ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS MUSCULUS L., ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕЦИПИТИРУЮЩИХ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К JGG ЧЕЛОВЕКА

Название	ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS MUSCULUS L., ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕЦИПИТИРУЮЩИХ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К JGG ЧЕЛОВЕКА
Разработчик (Авторы)	КНЯЗЕВА О.А., ЕФЕТОВ К.А., ТЭТИН С.Ю., ТРОИЦКИЙ Г.В.
Вид объекта патентного права	Изобретение
Регистрационный номер	2010856
Дата регистрации	15.04.1994
Правообладатель	КРЫМСКИЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ

Описание изобретения

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для структурных и функциональных исследований иммуноглобулинов G IgG человека, разработки иммунодиагностических препаратов в биологии и медицине.

Известны штаммы, продуцирующие моноклональные антитела (МКА) к IgG человека [1, 4] . Отличительное свойство предложенных МКА заключается в способности преципитировать IgG человека. Это свойство позволяет использовать МКА данного штамма в различных реакциях иммунодиффузии для диагностики миеломной болезни, аутоиммунных и других заболеваний, сопровождающихся изменением количественных соотношений белковых фракций.

Для гидридомного слияния [1, 4] использовались клетки миеломной линии NS₁, которые в отличие от используемой Sp 2/0 Ag 14, синтезируют легкие цепи иммуноглобулинов, способные встраиваться в молекулы антител [2] , что может приводить к инактивации части антител [3] и соответственно снижать эффективность применения для иммуноферментного анализа.

Также следует отметить, что каждая вновь полученная гибридома уникальна. МКА, продуцируемые разными гибридомами, различаются по своей первичной структуре, по специфичности к различным антигенным детерминантам, аффинности, способности связывать комплемент, цитотоксичности, гемагглютинирующим и другим свойствам. Поэтому получение как можно большего количества МКА к IgG человека важно с научной и практической точки зрения.

Технический результат изобретения заключается в получении штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L. , продуцирующего преципитирующие МКА к IgG человека.

Штамм получают следующим образом.

Мышей линии BALB/c иммунизируют внутрибрюшинным введением 100 мкг IgG (выделенного из сыворотки крови больного миеломной болезнью методом переосаждения сернокислым аммонием с последующей ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе) в 0,005 М фосфатном буферном растворе с 0,15 М NaCl рН 7,4 (РВS) с полным адъювантом Фрейнда. Иммунизацию повторяют через 4 недели, но антиген вводят без адъюванта. Через 4 недели мышей бустируют путем внутривенного введения 100 мкг IgG в PBS. Через 3 дня у животных определяют титр антител к IgG человека методом иммуноферментного анализа. Мышь с лучшим иммунным ответом используют для получения гибродомы. Для этого 10⁸ клеток миеломы Sp 2/p Ag14 в присутствии 50% -ного раствора полиэтиленгликоля с мол. м. 4000 (Merck, ФРГ). После гибридизации клетки высевают в 96-луночные планшеты по 10⁵ клеток на лунку. В качестве питающего слоя используют перитонеальные макрофагы мыши, которые высевают по 10⁴ клеток на лунку за сутки до гибридизации. Гибридому клонируют 2 раза методом лимитирующего разведения (из расчета 32 клетки на 96-луночный планшет), высевая клеток на слой перитонеальных макрофагов. После второго клонирования более 90% полученных субклонов продуцируют антитела к IgG человека. Наиболее продуктивный клон выводят в массовую культуру и обозначают 2FIIEII.

Штамм 2FIIEII характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Тип роста штамма - суспензионный, клетки округлой формы, расположены кластерами. Гибридома вызывает образование смешанных асцитных и солидных опухолей при прививке в перитонеальную полость мышей линии ВAL B/c в дозе 1 млн. клеток на мышь.

Культуральные признаки. Гибридому культивируют в пластиковых флаконах на 50-250 мл. Посевная доза - 5 ^. 10⁵ клеток на 1 мл. Кратность рассева 1: 5, время субкультивирования 3-4 дня. Среда для культивирования RPMI-1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, 2 мМ глутамина, 2 мМ пирувата, по 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина. В первые 3 недели после гибридизации в среду добавляют 10^-4 М гипоксантина, 4 ^. 10^-7 М аминоптерина и 1,6 ^. 10^-5 М тимидина, так как клетки миеломы Sp 2/0 Ag14 дефектны по ферменту гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансфе- разе. Клетки выращивают в атмосфере 5% СО₂ при 37^оС.

Культивирование в организме животного. Для выращивания гибридомы в асцитной форме клетки (10⁷) вводят в брюшную полость мышей ВАL B/c, которым предварительно (за 7-10 сут) внутрибрюшинно инъецируют пристан. Время образования асцита 10-14 дней.

Характеристика полезного продукта. МКА продуцируемые штаммом 2FIIEII, относятся к IgGI подклассу, специфически связывают IgG человека и в смеси с МКА гибридом 2НIIF9 или 3Н2Д2 преципитируют данный антиген. Принадлежность к подклассу IgG определяют при помощи преципитирующих сывороток против IgG мыши разных подклассов (Sigma, США) методом радиальной иммунодиффузии по Оухтерлони. Способность к преципитации с IgG человека определяют методом иммуноферментного анализа.

Продуктивность штамма, стабильность продукции антител. Концентрация МКА через 3-4 дня культивирования in vitro составляет 5-10 мкг/мл, в асцитной жидкости 5 мг/мл. Контроль продуктивности осуществляется с помощью иммуноферментного анализа, титр 1/5000. Продукция антител сохраняется в течение 30 пассажей в культуре и 25 пассажей на животных.

Контроль контаминации. Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на питательные среды. Заражение микоплазмой не выявлено при окрашивании красителями на ДНК.

Способ криоконсервирования. Для длительного хранения клетки штамма замораживают в фетальной бычьей сыворотке с добавление 10% диметилсульфоксида. Режи замораживания: сутки при -70^оС, затем ампулы с клетками переносят в жидкий азот. Размораживают клетки, перенося ампулу из жидкого азота в водяную баню на 37^оС. Жизнеспособность клеток после размораживания составляет 70-80% по окрашиванию трипановым синим.

П р и м е р 1. Гибридомные клетки помещают в пластиковый флакон площадью 25 см² по 5 ^. 10⁵ клеток в 5 мл среды RPMI-1640 с добавлением 10% фетальной сыворотки, по 2 мМ глутамина и пирувата, по 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина. Клетки культивируют 3-4 дня при 37^оС в атмосфере, содержащей 5% СО₂. Культуральную среду собирают, центрифугируют 10 мин при 800 об/мин. Супернатант, содержащий МКА к IgG человека, применяют в иммуноферментном анализе. В качестве антигенов используют различные иммуноглобулины, выделенные из сыворотки крови здоровых людей и больных миеломной болезнью методом переосаждения сернокислым аммонием с последующей ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе: IgG дон, IgGI Куз, IgGI Мис, IgGI Гол, IgG2 Рыб, IgG2 Боб, , IgG2 б/н, IgG3 Дал, IgG4 Жел, IgG4 Бер, IgА, а также IgM, выделенный из сыворотки крови больного болезнью Вальденстрема переосаждением бидистиллированной водой с последующей гельфильтрацией, и папаиновые Fab-, Fc- фрагменты IgG человека. Антигены разводят до концентрации 10 мкг/мл в 0,05 М Na-карбонатном буфере, рН 9,2 и вносят по 50 мкл в лунку 96-луночных планшетов. Инкубируют в течение 1 ч при 37^оС, затем сливают и вносят по 100 мкл в лунку 1% -ный раствор бычьего сывороточного альбумина (ВSA) на 1 ч при 37^оС. После окончания инкубации раствор BSA сливают, планшет промывают холодной водой и РВS с 0,05% твином (PBST), вносят супернатант культуральной среды по 50 мкл в лунку и инкубируют при 37^оС. Через час содержимое лунок сливают, лунки промывают холодной водой и РВSТ, добавляют по 50 мкл конъюгата кроличьих антител к IgG мыши с пероксидазой в разведении 1: 500 в растворе PBSТ и инкубируют при 37^оС 1 ч. После тщательного промывания в лунки вносят 0,4 мМ раствор субстрата - 2,2-азино-ди-3-этиленбензтиазолинсульфонат (6)] (АВTS) в 0,05 М Na-цитратном буфере, рН 4,0 с добавлением перекиси водорода до конечной концентрации 0,01% и инкубируют на шейкере при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем оценивают результат на спектрофотометре "Multiskan" (Flow, Великобритания) при длине волны 405 нм.

Полученные данные, выраженные в процентах от максимальной экстинкции (1,0-100% ), представлены в таблице.

Данные, представленные в таблице, свидетельствуют о том, что гибридома 2FIIEII продуцирует МКА, специфически взаимодействующие с IgG человека.

П р и м е р 2. На стеклянную пластину наливают 3% -ный раствор агара в РВS. Пробойником формируют лунки на расстоянии 0,6 см друг от друга. Асцитную жидкость штамма 2FIIEII, смешивают с асцитной жидкостью штамма 2НIIF9 или 3H2Д2 в соотношении 1: 1 и вносят в центральные лунки. В боковые лунки вносят IgG, IgA, IgM, BSA. Через 24 ч при взаимодействии IgG со смесью 2FIIEII с 2НIIF9 и со смесью 2FIIEII с 3Н2Д2 формируются полосы преципитации, которые не образуются в случае взаимодействия антител с IgA, IgM, BSA.

Таким образом, предложенный гибридный штамм продуцирует преципитирующие МКА, которые специфически взаимодействуют с IgG человека. Полученные антитела могут эффективно использоваться в биохимических и клинических исследованиях. (56)

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L. ВСКК(П) N 566 Д, используемый для получения преципитирующих моноклональных антител к Ig G человека.

Изобретение "ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS MUSCULUS L., ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕЦИПИТИРУЮЩИХ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К JGG ЧЕЛОВЕКА" (КНЯЗЕВА О.А., ЕФЕТОВ К.А., ТЭТИН С.Ю., ТРОИЦКИЙ Г.В.) отмечено юбилейной наградой (25 лет Российской Академии Естествознания)
Медаль Альфреда Нобеля

Оформление наградных документов и заказ каталога