СПОСОБ ВОСПРОИЗВЕДЕНИЯ ВОСПАЛИТЕЛЬНО-ИНФЕКЦИОННОГО ПРОЦЕССА НА КРЫСАХ

Название	СПОСОБ ВОСПРОИЗВЕДЕНИЯ ВОСПАЛИТЕЛЬНО-ИНФЕКЦИОННОГО ПРОЦЕССА НА КРЫСАХ
Разработчик (Авторы)	Домрачева М.Я., Панина Е.В., Савченков Ю.И., Цхай В.Б., Ефремов С.Н.
Вид объекта патентного права	Изобретение
Регистрационный номер	2196990
Дата регистрации	24.04.2000
Правообладатель	Красноярская государственная медицинская академия

Описание изобретения

Изобретение относится к области медицины и биологии и может быть использовано в гистологии, эмбриологии, микробиологии, фармакологии, физиологии, лабораторной диагностике.

Известен способ моделирования воспалительных заболеваний женских половых органов [6]. Однако этот способ предполагает использование микроорганизмов в виде St. aureus и введение микроорганизмов с помощью туберкулинового шприца под слизистую заднебоковой стенки средней трети влагалища. Недостатком этого способа моделирования является метод введения микроорганизмов, не имеющий аналогии с реальными путями проникновения микроорганизмов в женские половые органы.

Задача изобретения - разработать способ моделирования инфекционно-воспалительного процесса у крыс.

Выполнение поставленной задачи осуществляют путем введения на 2-4 или 11-13 дни беременности через уретру в мочевой пузырь белых крыс серовара кишечной палочки Е. coli О₆ в концентрации микробных тел 1•10⁷ КОЕ/мл по 0,1 мл на 100 грамм массы животного и при высевании кишечной палочки в конце беременности из почки судят о наличии воспалительно-инфекционного процесса.

Способ осуществляют следующим образом.

В качестве подопытных животных используют белых крыс половозрелого возраста, потому что они являются одними из наиболее распространенных лабораторных животных, которые позволяют достичь желаемой аналогии в эксперименте при воспроизведении инфекционно-воспалительного процесса.

Для его моделирования в качестве инфекционного агента используют кишечную палочку - Escherichia coli (E. coli) на том основании, что, во-первых, она не относится к возбудителям, вызывающим развитие инфекционно-воспалительного процесса в крайней степени его проявления - в виде инфекционной болезни, во-вторых, она является наиболее частой этиологической причиной формирования осложненной инфекции мочевыводящих путей вообще [1]. Среди большой разновидности эшерихий выбор был остановлен на сероваре кишечной палочки О₆, потому что этот серовар E. coli наблюдается при обструктивных и необструктивных формах урогенитальной инфекции, имея при этом высокий процент высеваемости [2]. Следовательно, использование кишечной палочки серотипа О₆ с точки зрения вероятности воспроизведения инфекционно-воспалительного процесса в мочевыводящих путях представляется оправданным.

С этой целью штамм E. coli О₆, производимый Государственным НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов имени Л.А. Тарасевича, культивируют на питательных средах в условиях термостата [4]. Стерильным физиологическим раствором готовят смыв колоний E. coli О₆ суточного возраста. Для заражения животных используют взвесь E. coli О₆ в концентрации микробных тел 1•10⁷ КОЕ/мл, приготовленную методом последовательных серийных десятикратных разведении. Для введения инфекционного агента крысу под легким эфирным наркозом иммобилизируют на спине. Соблюдая правила асептики и антисептики, катетер через уретру вводят в мочевой пузырь, затем через катетер с помощью шприца в мочевой пузырь вводят взвесь микроорганизмов. На каждые 100 гр массы животного вводят 0,1 мл взвеси микроорганизмов в концентрации 1•10⁷ КОЕ/1 мл. Сразу после введения через катетер взвеси микроорганизмов или стерильного физиологического раствора в полость мочевого пузыря катетер извлекают, а животное освобождают от иммобилизации.

Все подопытные животные по объему воздействия были разделены на 4 группы (табл. 1.).

I группа животных - это контрольная группа животных. Животным этой группы иммобилизацию и катетеризацию не проводят. II, III и IV группы животных - это опытные группы. Каждому животному из этих групп один раз в сутки и три дня подряд производят катетеризацию мочевого пузыря. Животным второй группы в мочевой пузырь вводят стерильный физиологический раствор в расчете 0,1 мл физиологического раствора/100 грамм массы животного. Животным третьей и четвертой групп вводят взвесь Е. coli О₆ в концентрации 1•10⁷ КОЕ/1 мл стерильного физиологического раствора в расчете 0,1 мл взвеси/100 грамм массы крысы. Катетеризацию мочевого пузыря с введением в его полость взвеси микроорганизмов осуществляют: для животных III группы - на 2-4-й дни беременности, для животных IV группы - на 11-13-й дни беременности. Такая структура эксперимента позволяет: на примере второй группы выявить негативное влияние иммобилизации и катетеризации на процессы гестации; на примере третьей и четвертой групп животных установить возникновение наличие инфекционно-воспалительного процесса в мочевыводящих путях в различные сроки беременности. Создание инфекционно-воспалительного процесса во время беременности выбрано на том основании, что гормональный фон беременности является благоприятным фоном для реализации инфекционно-воспалительного процесса, а мочевыводящие пути доступны для инфицирования. Для оценки наличия инфекционно-воспалительного процесса мочевыводящих путей к исходу беременности, длящейся у крыс в среднем 21-22 дня, животных всех четырех групп накануне родов - на 20-й день беременности - подвергают эвтаназии. При этом проводят ряд объективных наблюдений, гематологических и микробиологических исследований, позволяющих выявить наличие инфекционно-воспалительного процесса и произвести сопоставление с данными морфометрических исследований.

В табл. 2 приведены объективные данные хода беременности на 20-й день беременности.

Из табличных данных следует, что 100%-я выживаемость самок к 20-у дню беременности и примерно равная сохранность беременности свидетельствует об отсутствии очевидных признаков сепсиса. В группах III и IV отмечается тенденция к снижению количества вынашиваемых плодов в абсолютных и относительных величинах по сравнению с группами I и II, что отражает наличие нарушенного хода беременности на фоне введения микроорганизмов в мочевыводящие пути беременной самке.

В табл. 3 приведены данные гематологических исследований.

Гематологические данные групп I и II практически совпадают. Это означает, что проведение иммобилизации и катетеризации не приводит к появлению признаков воспалительной реакции со стороны системы крови.

Характер изменения гематологических величин в группах III и IV по сравнению с контролем имеет особенности. Для этих экспериментальных групп характерна тенденция: снижения количества эритроцитов, уровня гемоглобина и увеличения числа лейкоцитов. Изменение лейкоцитарной формулы в этих группах характеризуется тенденцией к нейтрофилии, моноцитозу, лимфопении. Выявляемые изменения лейкоцитарной формулы отражают наличие воспалительной реакции в организме крыс этих групп. Увеличение индекса интоксикации в группах III и IV также подтверждает проявление инфекционно-воспалительной реакции в организме беременных крыс-самок. Таким образом, введение инфекционного агента беременным крысам отражается в гематологических параметрах в виде воспалительной реакции с интоксикационным синдромом.

Для выявления инфекционно-воспалительного процесса в мочевыводящих путях производят посев материнской почки методом отпечатка. Процедуру забора биоматериала для микробиологического исследования осуществляют с соблюдением всех правил асептики в течение ближайших минут с момента эвтаназии животного. Культивирование, идентификацию выделенных культур осуществляют согласно Приказа 535 МЗ СССР от 22 апреля 1985 года [4]. С целью выявления любого возможного инфекционного агента посевы проводят на неселективные среды - отдельно для выделения аэробов, отдельно для анаэробов. Роста колоний на анаэробных средах не наблюдали ни в одном случае. На аэробных средах наблюдали рост колоний только одного вида микроорганизмов, которые были подвергнуты дальнейший идентификации на питательных средах [4]. В табл. 4 приведены данные идентификации и частоты высеваемости микроорганизмов. Табличные данные свидетельствуют, что вводимая в мочевыводящие пути во время беременности кишечная палочка высевалась в конце беременности из почки. С учетом способа инфицирования это свидетельствует о наличии инфекционно-воспалительного процесса в мочевыводящих путях. Совпадение серовара кишечной палочки, вводимой в мочевой пузырь, и серовара кишечной палочки, высеваемой из почки, доказывает материальную и причинно-следственную взаимосвязь этих процессов. Таким образом, введение Е. coli О₆ в мочевыводящие пути в различные сроки беременности приводит к возникновению инфекционно-воспалительного процесса мочевыводящих путей.

Для проведения морфометрического исследования проводят забор почки, мочеточника и стенки мочевого пузыря. Материал фиксируют в 10%-м нейтральном формалине, проводят по спиртам и заливают в парафин. Гистологические срезы толщиной 5 мкм окрашивают гематоксилинэозином и по Ван-Гизону [3].

Готовые микропрепараты подвергают световой микроскопии при 600-кратном увеличении с целью выявления микроочагов воспаления. При определении такового в поле зрения в нем подсчитывают количество лимфоцитов, гистиоцитов и нейтрофилов на том основании, что скопления этих клеток, во-первых, отражают наличие воспалительной реакции в ткани, во-вторых, указывают на точную локализацию инфекционного агента [5]. Выбор 600-кратного увеличения обоснован тем, что использование такого увеличения позволяет достаточно быстро просматривать микропрепарат, выявлять очаги воспаления, дифференцировать клеточные элементы в очаге воспаления и иметь достаточное количество полей зрения одновременно.

В табл. 5 приведены данные морфометрических исследований почек по признакам, позволяющим судить о наличии инфекционно-воспалительного процесса.

В микропрепаратах почек, полученных от животных групп III и IV, по сравнению с контрольной группой наблюдают достоверное увеличение количества лимфоцитов и гистиоцитов в выявленных микроочагах воспаления.

В табл. 6 приведены данные морфометрических исследований стенки мочеточника по признакам, позволяющим судить о наличии инфекционно-воспалительного процесса. В микропрепаратах, полученных от животных групп III и IV, по сравнению с контрольной группой, наблюдают достоверное увеличение количества лимфоцитов в выявленных микроочагах воспаления.

В табл. 7 приведены данные морфометрических исследований стенки мочевого пузыря по признакам, позволяющим судить о наличии инфекционно-воспалительного процесса.

В микропрепаратах стенки мочевого пузыря, полученных от животных групп III и IV, также наблюдают достоверное увеличение количества лимфоцитов в выявленных микроочагах воспаления.

Таким образом, из данных морфометрических исследований следует, что количество лимфоцитов в микроочаге воспаления у животных III и IV групп статистически достоверно (р<0,05) по сравнению с группой I (контрольной группой) отражает наличие инфекционно-воспалительного процесса, выявляемого по данным объективного наблюдения и данным гематологических и микробиологических исследований.

При этом установлено, что количественная мера одного из возможных морфометрических критериев описания инфекционно-воспалительного процесса - лимфоцитов - является статистически достоверной в отражении существования такового. Следовательно, подсчет числа лимфоцитов в микроочаге воспаления может использоваться для количественного учета воспалительной реакции и применяться для проведения количественного сравнительного анализа при проведении морфометрических исследований.

Из достоинств предлагаемого способа количественной оценки инфекционно-воспалительного процесса при морфометрическом исследовании органов крыс можно выделить следующие моменты: 1) возможность проведения количественной оценки воспаления параллельно с общепринятым качественным описанием микропрепарата, 2) отсутствие изменения технологии приготовления и микроскопирования микропрепарата, 3) простота учета лимфоцитов, позволяющая говорить о наличии экспресс-свойств у предлагаемого способа.

Таким образом, упоминаемые достоинства предлагаемого способа позволяют считать его простым и удобным методом количественного учета воспалительной реакции организма, переводящим качественное описание микропрепаратов в рамки количественного учета, что открывает собой возможность проведения сравнительного анализа в рамках одного эксперимента или сопоставления данных различных экспериментов.

Источники информации
1. Идентификация возбудителей инфекций мочевыводящих путей у детей /В.И. Кириллов, Л.Т. Теблоева, Е.Б. Алексеев и соавт. //Педиатрия. -1997.- 6. -С. 8-13.

2. Лопаткин Н. А., Деревянко И.И. Неосложненные и осложненные инфекции мочеполовых путей. Принципы антибактериальной терапии //Русский медицинский журнал. - 1997, Т.5. - 24. - С. 1579-1588.

3. Ромейс Б. Микроскопическая техника. - М.: Медгиз, 1954. - 718 с.

4. Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях, лечебно-профилактических учреждениях /Приказ 535 МЗ СССР от 22 апреля 1985 г. - М., 1985. - 127 с.

5. Чернух А. Н. Воспаление. - М.: Медицина, 1979. - 448 с.

6. Старкова Е.В., Дергачева Т.И., Асташов В.В. Способ моделирования воспалительных заболеваний женских половых органов /Патент РФ 2142163 С1, 27.11.1999. Институт клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН.

Формула изобретения

Способ воспроизведения инфекционно-воспалительного процесса на крысах осуществляют путем введения на 2-4 или 11-13 дни беременности через уретру в мочевой пузырь белых крыс серовара кишечной палочки Е. coli O₆ в концентрации микробных тел 1•10⁷ КОЕ/мл по 0,1 мл на 100 г массы животного и при высевании кишечной палочки в конце беременности из почки судят о наличии воспалительно-инфекционного процесса.

Изобретение "СПОСОБ ВОСПРОИЗВЕДЕНИЯ ВОСПАЛИТЕЛЬНО-ИНФЕКЦИОННОГО ПРОЦЕССА НА КРЫСАХ" (Домрачева М.Я., Панина Е.В., Савченков Ю.И., Цхай В.Б., Ефремов С.Н.) отмечено юбилейной наградой (25 лет Российской Академии Естествознания)
Медаль Альфреда Нобеля

Оформление наградных документов и заказ каталога