СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ГЕСТАЦИОННОГО ПИЕЛОНЕФРИТА НА ФОНЕ ИНФЕКЦИОННО-ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО ПРОЦЕССА МОЧЕВЫВОДЯЩИХ ПУТЕЙ

Название	СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ГЕСТАЦИОННОГО ПИЕЛОНЕФРИТА НА ФОНЕ ИНФЕКЦИОННО-ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО ПРОЦЕССА МОЧЕВЫВОДЯЩИХ ПУТЕЙ
Разработчик (Авторы)	Домрачева М.Я., Панина Е.В., Савченков Ю.И., Цхай В.Б.
Вид объекта патентного права	Изобретение
Регистрационный номер	2202834
Дата регистрации	24.04.2000
Правообладатель	Красноярская государственная медицинская академия

Описание изобретения

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано в акушерстве, гинекологии, педиатрии, неонатологии, фармакологии, микробиологии, физиологии, гистологии, лабораторной диагностике.

В зарубежной и отечественной справочно-информационной литературе аналогов заявляемому способу моделирования гестационного пиелонефрита нет.

Задача изобретения - разработать модель гестационного пиелонефрита, развивающуюся на фоне инфекционно-воспалительного процесса мочевыводящих путей и максимально приближенную к аналогии подобного процесса в человеческом организме.

Выполнение поставленной задачи осуществляют путем трехразового введения взвеси микроорганизмов Escherichia coli штамма O₆ в мочевой пузырь беременной крысы.

Способ осуществляют следующим образом.

В качестве подопытных животных используют белых беспородных крыс, потому что эти лабораторные животные крысы обладают непродолжительной беременностью - 21-22 дня. Кроме того, крысы способны вынашивать беременность независимо от времени года.

Для моделирования инфекционно-воспалительного процесса в качестве инфекционного агента используют кишечную палочку - Escherichia coli (Е. coli) на следующем основании. Во-первых, возникновение гестационного пиелонефрита происходит только на фоне урогенитальной инфекции. Известно, что ведущую этиологическую роль в его возникновении принадлежит Е. coli [8]. Во-вторых, она является наиболее частой этиологической причиной формирования осложненной инфекции мочевыводящих путей вообще [4]. Среди большой разновидности эшерихий по O-антигену выбор был остановлен на сероваре кишечной палочки O₆, потому что этот серотип Е. coli наблюдается при обструктивных и необструктивных формах урогенитальной инфекции и занимает при этом второе место по высеваемости [5] . Занимающий первое место по высеваемости серотип кишечной палочки O₉ использовать нецелесообразно в связи с тем, что Е. coli О₉, как возбудитель урогенитальной инфекции, свои патогенные качества реализует только в условиях обструкции мочевыводящих путей [4]. Следовательно, использование кишечной палочки серотипа O₆ с точки зрения вероятности воспроизведения инфекционно-воспалительного процесса в мочевыводящих путях представляется наиболее оправданным.

С этой целью штамм Е. coli О₆, производимый Государственным НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов имени Л.А. Тарасовича, культивируют на питательных средах в условиях термостата. Стерильным физиологическим раствором готовят смыв колоний Е. coli О₆, суточного возраста. Для заражения животных используют взвесь Е. coli O₆, в концентрации микробных тел 1•10⁷ КОЕ/мл, приготовленную методом последовательных серийных десятикратных разведений.

Соблюдая правила асептики и антисептики, катетер через уретру вводят в мочевой пузырь, затем через катетер с помощью шприца в мочевой пузырь вводят взвесь микроорганизмов. На каждые 100 г массы животного вводят 0,1 мл взвеси микроорганизмов в концентрации 1•10⁷ КОЕ /1 мл.

Для осуществления катетеризации мочевого пузыря крысу под легким эфирным наркозом иммобилизируют на спине. Процесс иммобилизации крысы на спине с окончанием действия эфирного наркоза всегда сопровождался актом мочеиспускания. Этот факт свидетельствует о том, что мочевой пузырь опорожнен и позволяет ввести в него определенный объем жидкости. Во избежание инициации повторного рефлекторного мочеиспускания у крысы за счет раздражения терморецепторов стенки мочевого пузыря температура шприца, его содержимого и катетера с помощью термостата поддерживают на уровне температуры внутренних органов крысы - 37,0^oС. Кроме того, во избежание раздражения механорецепторов стенки мочевого пузыря с инициацией повторного рефлекторного мочеиспускания используют малый объем жидкости - 0,1 мл на 100 г массы тела крысы. Это связано с тем, что объем внутрипузырной жидкости 0,1 мл и объем мочевого пузыря при массе тела крысы 100 г соотносятся между собой как 1/7-1/5. Следовательно, заполнение пустого мочевого пузыря на 1/7-1/5 его объема жидкостью, имеющей температуру, равную температуре внутренних органов крысы, не будет инициировать рефлекторное мочеиспускание. Это предположение было подтверждено собственными наблюдениями: катетеризация мочевого пузыря у иммобилизованного на спине животного с введением жидкости в мочевой пузырь при соблюдении вышеописанных условий ни разу не сопровождалась рефлекторным актом мочеиспускания.

Сразу после введения через катетер стерильного физиологического раствора или взвеси микроорганизмов в полость мочевого пузыря катетер извлекают из уретры, а животное освобождают от иммобилизации.

Все подопытные животные по объему воздействия были разделены на 4 группы (таблица 1).

I группа животных - это контрольная группа животных. Животным этой группы иммобилизацию и катетеризацию не проводят. II, III и IV группы животных - это опытные группы. Каждому животному из этих групп один раз в сутки и три дня подряд производят катетеризацию мочевого пузыря. Животным второй группы в мочевой пузырь вводят стерильный физиологический раствор в расчете 0,1 мл физиологического раствора/100 г массы животного. Животным третьей и четвертой групп вводят взвесь Е. coli O₆ в концентрации 1•10⁷ КОЕ/1 мл стерильного физиологического раствора в расчете 0,1 мл взвеси/100 г массы крысы. Катетеризацию мочевого пузыря с введением в его полость взвеси микроорганизмов осуществляют: для животных III группы - на 2-4-й день беременности, для животных IV группы - на 11-13-й день беременности.

Такая структура эксперимента позволяет: на примере второй группы выявить негативное влияние иммобилизации и катетеризации на процессы гестации; на примере третьей и четвертой групп животных установить возникновение гестационного пиелонефрита и наличие инфекционно-воспалительного процесса в мочевыводящих путях.

Для оценки условий течения и исхода беременности, длящейся у крыс в среднем 21-22 дня, животных всех четырех групп накануне родов - на 20-й день беременности - подвергают эвтаназии. При этом проводят ряд гравиметрических, гематологических, микробиологических и морфометрических исследований.

В таблице 2 приведены объективные данные хода беременности на 20-й день беременности.

Наличие одинаковых показателей выживаемости животных и вынашиваемости беременности в группах I и II свидетельствует об отсутствии негативного влияния наркотизации животного с целью иммобилизации и самой иммобилизации на гестационные процессы. Примерное совпадение среднего количества плодов в абсолютных и относительных цифрах у животных этих групп отражает отсутствие эмбриотоксического эффекта трехразовой эфирной наркотизации легкой степени и стрессового влияния трехразовой иммобилизации беременной самки на спине.

Выживаемость самок в группах III и IV по сравнению с группой I указывает, что введение взвеси Е. coli О₆ не приводит к развитию септических состояний. Примерно одинаковый результат по сравнению с контролем наблюдается и по вынашиваемости беременности (90,9% и 8 1.8% против 90,9%). В то же время, при отсутствии статистической достоверности различий между абсолютными значениями среднего количества плодов в группах III и IV, отмечается тенденция к их снижению в относительных величинах. Так, если принять среднее значение плодов в группе I за 100%, то значение среднего числа плодов в группе III составит 84,25%, в группе IV - 91,95%.

Таким образом, по данным таблицы 2 можно утверждать, что использование инфекционного агента не оказывает решающего влияния на объективные параметры условий протекания беременности, то есть на выживаемость беременной крысы-самки и вынашиваемость беременности. В то же время, инфицирование мочевыводящих путей во время беременности имеет тенденцию негативного влияния инфекционного агента на гестационные процессы в виде снижения вынашиваемости беременности и снижения среднего количества плодов, определяемых в полости матки у крыс групп III и IV.

В таблице 3 приведены данные гравиметрических измерений. Значения учитываемых признаков между группами I и II практически совпадают. Следовательно, различия между группами I и III, I и IV будут связаны с введением инфекционного агента в мочевыводящие пути.

На первый день беременности средняя масса животных во всех группах практически совпадает. Средняя масса самок к 20-му дню беременности увеличивается, а средний прирост массы тела самки в группах III и IV имеют наибольшие значения (35,22 г и 30,78 г соответственно против 22,40 г в контроле). Следовательно, процесс протекания беременности в группах III и IV имеет особенности по сравнению с контрольной группой. В группе IV средние массы плода, плаценты, средняя масса плодов и плацент в вынашиваемом помете имеют тенденцию к росту выше контрольных значений, а в группе III - ниже контрольных. Это следует оценивать как срыв адаптационных процессов материнского организма в метаболическом обеспечении фетоплацентарного комплекса у животных группы III в декомпенсированной, а у животных группы IV и компенсированной форме.

Следовательно, по данным гравиметрических исследований можно утверждать, что создание у беременной крысы-самки инфекционно-воспалительного процесса в мочевыводящих путях в обе половины беременности приводит к нарушению нормального хода беременности.

В таблице 4 приведены данные гематологических исследований.

Гематологические данные групп I и II практически совпадают. Характер изменения гематологических величин в группах III и IV по сравнению с контролем имеет особенности. Для этих экспериментальных групп характерна тенденция: снижения количества эритроцитов, уровня гемоглобина и увеличения числа лейкоцитов. Изменение лейкоцитарной формулы в этих группах характеризуется тенденцией к нейтрофилии, моноцитозу, лимфопении. Выявляемые изменения лейкоцитарной формулы отражают наличие воспалительной реакции у беременных крыс. Увеличение индекса интоксикации в группах III и IV также подтверждает проявление инфекционно-воспалительной реакции в организме беременных самок. Таким образом, введение инфекционного агента беременным крысам отражается в гематологических параметрах в виде воспалительной реакции с интоксикационным синдромом.

Для выявления гестационного пиелонефрита производили посев материнской почки. Процедуру забора биоматериала для микробиологического исследования осуществляли с соблюдением всех правил асептики в течение ближайших минут с момента эвтаназии животного. Культивирование, идентификацию выделенных культур осуществляли согласно приказу 535 М3 СССР от 22 апреля 1985 года [6].

С целью выявления любого возможного инфекционного агента посевы проводили на неселективные среды - отдельно для выделения аэробов, отдельно для анаэробов. Роста колоний на анаэробных средах не наблюдали ни в одном случае. На аэробных средах наблюдали рост колоний только одного вида микроорганизмов, которые были подвергнуты дальнейшей идентификации на питательных средах [6] . В таблице 5 приведены данные идентификации и частоты высеваемости.

Табличные данные свидетельствуют, что вводимая в мочевыводяшие пути во время беременности кишечная палочка высевалась к конце беременности из почки. С учетом способа инфицирования это свидетельствует о наличии нефрита инфекционно-воспалительной природы. Совпадение серотипа кишечной палочки, вводимой в мочевой пузырь, и серотипа кишечной палочки, высеваемой из почки, доказывает материальную взаимосвязь этих процессов. Таким образом, введение Е. coli O₆, в мочевыводящие пути в различные сроки беременности приводит к возникновению нефрита с очевидной инфекционно-воспалительной причиной, то есть пиелонефриту.

Выбор концентрации микроорганизмов для введения в мочевой пузырь беременной крысы связан с тем, что истинная бактериурия при инфекции мочевыводящих путей составляет 1•10⁵ КОЕ/1 мл мочи [1, 7]. Поэтому использование взвеси микробных тел в концентрации 1•10⁷ КОЕ/1 мл с введением этой взвеси из расчета 0,1 мл взвеси на 100 г веса животного при массе животных в 150-200 г предполагает введение дозы микробов в количестве (1,5-2)•10⁶ КОЕ. Таким образом, концентрация микробных тел 1•10⁷ КОЕ/мл позволяет одновременно: 1) осуществить введение дозы микроорганизмов на один порядок выше истинной бактериурии, то есть дозы 1•10⁶ КОЕ/100 г массы, с целью создания первичного инфекционно-воспалительного процесса в мочевыводящих путях, 2) осуществить количественное введение инфекционного агента пропорционально массе тела, а следовательно, и полостям мочевыводящей системы.

Выбор трехразового введения микроорганизмов сделан на основе экспериментального подбора (таблица 6) и объясняется тем, что одноразовое введение даже более высокой дозы микроорганизмов не приводит к развитию урогенитальной инфекции, а увеличение числа введений приводит к резкому снижению вынашиваемости беременности.

Это подтверждает известные данные о том, что вероятность развития инфекции мочевыводящих путей определяется гормональным фоном беременности и нарушением уродинамики во время беременности [5,8]. Поэтому использование трехразового введения взвеси микроорганизмов в мочевой пузырь является обязательным условием воспроизведения гестационного пиелонефрита.

В таблице 7 приведены данные морфометрического исследования материнских почек по признакам, позволяющим судить о наличии нефрита.

В группах III и IV наблюдается рост числа лимфоцитов, гистиоцитов, нейтрофилов и случаев паранефрита. При этом увеличение количества лимфоцитов и гистиоцитов достигает достоверного уровня различий. Учитывая данные микробиологических исследований (таблица 5) и данные морфометрии (таблица 7), можно утверждать наличие нефрита.

На основании полученных результатов объективного наблюдения, гравиметрических, гематологических, микробиологических и морфометрических исследований можно утверждать, что введение в мочевыводящие пути беременной крысы взвеси микроорганизмов Eschenchia coil O₆ в различные сроки беременности приводит к возникновению пиелонефрита во время беременности, то есть гестационному пиелонефриту.

Из достоинств предлагаемого способа моделирования гестационного пиелонефрита можно выделить следующие моменты: 1) протяженность беременности крыс в 21-22 дня позволяет проводить эксперименты в относительно непродолжительные сроки, 2) воспроизведение первичного источника инфекционно-воспалительного процесса в мочевыводящих путях материнского организма имеет реальную сопоставимость с проблемой гестационного пиелонефрита для человека, 3) возникновение и протекание пиелонефрита в эксперименте протекает без очевидных признаков нарушенного хода беременности, что характерно для протекания подобного процесса и у человека, 4) проведение эксперимента на крысах имеет низкую себестоимость исследований.

Таким образом, упоминаемые достоинства предлагаемого способа позволяют считать его адекватной моделью гестационного пиелонефрита, имеющего место у человека. Экспериментальное исследование патогенеза гестационного пиелонефрита по предлагаемому способу позволит определять направления коррекции и профилактики формирующейся патологии беременности с целью предупреждения рождения неполноценного потомства и охраны здоровья матери.

Формула изобретения

Способ моделирования гестационного пиелонефрита на фоне инфекционно-воспалительного процесса мочевыводящих путей осуществляют путем трехразового введения взвеси микроорганизмов Escherichia coli штамма O₆ в мочевой пузырь беременной крысы.

Изобретение "СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ГЕСТАЦИОННОГО ПИЕЛОНЕФРИТА НА ФОНЕ ИНФЕКЦИОННО-ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО ПРОЦЕССА МОЧЕВЫВОДЯЩИХ ПУТЕЙ" (Домрачева М.Я., Панина Е.В., Савченков Ю.И., Цхай В.Б.) отмечено юбилейной наградой (25 лет Российской Академии Естествознания)
Медаль Альфреда Нобеля

Оформление наградных документов и заказ каталога