Способ получения иммуноглобулинового препарата для наружного применения

Название	Способ получения иммуноглобулинового препарата для наружного применения
Разработчик (Авторы)	Мелихова А.В., Климова Э.В., Давыдкин В.Ю., Алешкин В.А., Давыдкин И.Ю.
Вид объекта патентного права	Изобретение
Регистрационный номер	2616266
Дата регистрации	18.12.2015
Правообладатель	Федеральное Бюджетное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Описание изобретения

Изобретение относится к медицине и биотехнологии и касается способа получения иммуноглобулиновых препаратов, очищаемых от примесей солями металлов из экстрактов осадка Б (III фракции по Кону).

У человека существует пять классов антител - IgA, IgD, IgE, IgG, IgM. Основную массу из их общего количества составляет IgG - до 70%, в меньших количествах содержится IgA - 10-15% и IgM - 5-10%, наименьшее количество приходится на оставшиеся IgD и IgE - одинаково по 0,2%.

Некоторые функции отдельных классов иммуноглобулинов дублируются, например активация комплемента и усиление фагоцитоза у IgG и IgM, но это дублирование является лишь следствием проявления индивидуальных свойств каждого.

IgA - основной класс антител в секретах (молоке, слюне, слезах, желчи, секретах дыхательных путей, кишечного тракта и влагалища), защищает слизистые оболочки и нейтрализует вирусы и бактериальные токсины.

IgD - единственная известная его функция - роль рецептора для антигена.

IgE - защищает слизистые оболочки, контактирующие с окружающей средой. Молекулы иммуноглобулина прикрепляются к специфическим рецепторам поверхности тучных клеток и базофилов, и если происходит связывание с антигеном, то образуется комплекс, стимулирующий освобождение из клеток медиаторов аллергических реакций.

IgG - единственные антитела, переходящие от матери к плоду через плаценту, иммуноглобулин производится в больших количествах при вторичном иммунном ответе. Помимо активации системы комплемента молекулы IgG связываются с макрофагами и нейтрофилами. Эти фагоцитирующие клетки могут связывать, поглощать и разрушать внедрившиеся микроорганизмы, покрытые IgG-антителами, которые вырабатываются в ответ на инфекцию.

IgM - основной класс антител, выделяемых в кровь на ранних стадиях первичного иммунного ответа. Присоединение антигена к молекуле IgM индуцирует его связывание с системой комплемента и его активацию. Если антиген расположен на поверхности внедрившегося микроорганизма, то в результате активации система комплемента осуществляет биохимическую атаку, приводящую к гибели микроорганизма [1].

Иммуноглобулины IgD и IgE по причине их малого количества очень трудно выделить, и при производстве иммуноглобулиновых препаратов на них, как правило, не обращают внимания. Поэтому основной целью производителей является создание препаратов, содержащих или один IgG (для внутривенного введения) или комплекс IgG, IgA, IgM в разных сочетаниях (для перорального и назального применения).

Как следует из анализа функциональных свойств классов иммуноглобулинов, препараты, предназначенные для лечения слизистых человека, должны содержать в больших количествах IgA и IgM.

IgA - как обеспечивающий защиту слизистых от внедрения патогенных агентов. Если же проникновение инфекционного начала уже произошло, то как блокирующий дальнейшее поступление бактерий или вирусов через «входные ворота инфекции» и нейтрализующий их.

IgM - как пусковой механизм первичного иммунного ответа организма и активатор системы комплемента.

Содержание IgG также необходимо в препарате, но его необязательно должно быть много, так как его недостаток в препарате с лихвой компенсируется вторичным иммунным ответом организма на инфекцию. В данном случае гораздо важнее на начальном этапе инфекционного процесса помочь организму организовать оборону посредством функциональных особенностей IgA и IgM.

В последнее время расширяется область применения иммуноглобулиновых препаратов для лечения инфекционных заболеваний человека. Помимо энтерального применения комплексного иммуноглобулинового препарата (КИП) в борьбе с острыми кишечными инфекциями предложено использовать его для лечения острых респираторных заболеваний у детей [2, 3]. Применяется КИП также местно в комбинированных препаратах с интерфероном [4].

Известен способ получения иммуноглобулиновых композиций, состоящих из IgG, IgA, IgM, для внутривенного применения, включающий гомогенизацию осадка Б в 0,01 М фосфатном буферном растворе (PBS) с рН 7,6, добавление в него соли ртути (мертиолата) до конечной концентрации 0,1%, отделение осадка иммуноглобулинов с последующей гомогенизацией, обработку протамином и очистку полученного раствора от нерастворимых примесей [5].

Основным недостатком этого изобретения является то, что оно может быть использовано только для получения иммуноглобулинов для тест-систем.

Известен способ получения иммуноглобулинового препарата для перорального применения, в соответствии с которым осадок Б экстрагируют в десятикратном объеме 0,9% раствора хлорида натрия при комнатной температуре и постоянном перемешивании 0,1-3,0% хлороформом, удаляют балластные примеси центрифугированием, обрабатывают фракции иммуноглобулинов сульфатом меди с конечной концентрацией 0,1-2,0% при рН раствора 6-8, раствор центрифугируют и обрабатывают раствором ЭДТА в концентрации 0,2-1,0%, диализируют и концентрируют методом ультрафильтрации до концентрации белка 6%, стабилизируют, подвергают осветляющей и стерилизующей фильтрации и высушивают сублимацией [6].

Однако препарат, полученный по известному способу [6], не предназначен для наружного использования (местного применения на слизистых), в том числе в качестве глазных капель, для назального применения. Использование хлороформа при его получении оказывает токсическое действие на пациента и персонал, снижает биологическую эффективность целевого продукта. Известный способ предполагает повышение концентрации только иммуноглобулина класса М.

В качестве прототипа нами выбран способ получения иммуноглобулинов, обладающих антибактериальной и антивирусной активностью, предназначенных для применения в виде назальных капель [7]. Известное средство создано на основе комплексного иммуноглобулинового препарата (КИП) с использованием глицерина.

Однако использование фармацевтически приемлемых добавок, в том числе глицерина, сопровождается снижением содержания иммуноглобулинов классов А и М и, соответственно, повышением иммуноглобулина класса G. Снижены также возможности применения препарата на других слизистых, так наличие глицерина не позволяет использовать его в офтальмологии.

Нами поставлена задача разработать способ получения иммуноглобулинового препарата для наружного применения, обладающего повышенным содержанием иммуноглобулинов классов А и М и высокой биологической активностью при упрощении технологического процесса стадии удаления балластных примесей.

Технический результат, получаемый при осуществлении изобретения, заключается в:

- повышении клинической эффективности иммуноглобулинового препарата для наружного применения за счет повышения содержания иммуноглобулинов классов А и М, сохранения специфической биологической активности антител препарата путем совершенствования технологии осаждения балластных примесей;

- исключении токсического воздействия на пациента и персонал путем исключения использования при осаждении примесей хлороформа и полиэтиленгликоля.

Сущность изобретения заключается в следующем.

Способ получения иммуноглобулинового препарата для наружного применения включает стадию экстракции осадка Б (III фракция по Кону) раствором хлористого натрия, удаление балластных примесей и выделение целевого продукта методом ультрафильтрации в присутствии комплексообразующих соединений. При этом удаление балластных примесей осуществляют путем последовательной обработки экстракта сначала мертиолатом в концентрации 0,1%, а затем сульфатом меди в концентрации 0,005-0,06%) при величине рН 8,0.

Повышенное содержание иммуноглобулинов классов А и М в препарате обеспечивается использованием для выделения примесных белков предлагаемых нами солей металлов.

Нами впервые показано, что сочетание мертиолата с сульфатом меди при рН, равном 8, обеспечивает комплексное повышенное содержание (более 30%) в препарате иммуноглобулинов IgA и IgM, что повышает эффективность местного применения препарата, например на слизистых глаз. Кроме того, такое сочетание исключает необходимость введения в препарат консервантов и стабилизаторов. Близкий к нейтральному рН препарата при использовании 0,85%-ного раствора хлорида натрия исключает необходимость введения дополнительных веществ для обеспечения изотоничности препарата.

Мягкая очистка препарата в предлагаемом способе позволяет сохранить специфическую активность его антител. Используемые соли металлов (предлагаемая последовательность их использования и указанная величина рН) позволяют уменьшить содержание примесных белков и липопротеинов в целевом продукте, произвести его эффективную очистку.

Предлагаемый способ обеспечивает повышенное содержание в препарате иммуноглобулинов классов А и М, что позволит использовать препарат для местного применения, например в качестве глазных капель или на других слизистых.

Формула изобретения

Способ получения иммуноглобулинового препарата для наружного применения, включающий стадию экстракции осадка Б (III фракция по Кону) раствором хлористого натрия, удаление балластных примесей и выделение целевого продукта методом ультрафильтрации в присутствии комплексообразующих соединений, отличающийся тем, что удаление балластных примесей осуществляют путем последовательной обработки экстракта сначала мертиолатом в концентрации 0,1%, а затем сульфатом меди в концентрации 0,005-0,06% при величине pH 8,0.

Изобретение "Способ получения иммуноглобулинового препарата для наружного применения" (Мелихова А.В., Климова Э.В., Давыдкин В.Ю., Алешкин В.А., Давыдкин И.Ю.) отмечено юбилейной наградой (25 лет Российской Академии Естествознания)
Медаль Альфреда Нобеля

Оформление наградных документов и заказ каталога