СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОГЛОБУЛИНОВОГО ПРЕПАРАТА

Название	СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОГЛОБУЛИНОВОГО ПРЕПАРАТА
Разработчик (Авторы)	Зорик А.В., Алешкин В.А.,Лютов А.Г.,Борисова И.В.
Вид объекта патентного права	Изобретение
Регистрационный номер	2189833
Дата регистрации	19.10.2000
Правообладатель	Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.Габричевского

Описание изобретения

Изобретение относится к медицине, а именно к лекарственным препаратам, содержащим белковые вещества, и может быть использовано при получении комплексного иммуноглобулинового препарата для энтерального применения.

Препараты, содержащие несколько классов иммуноглобулинов, а именно IgA, IgM, IgG - высокоэффективные средства лечения и профилактики различных инфекционных заболеваний, представляющие собой концентраты антител, опсонизирующая, нейтрализующая и комплементсвязывающая активность которых является основным фактором их клинической эффективности.

В настоящее время в мире выпускаются и применяются в клинике иммуноглобулиновые препараты, обогащенные IgM и IgA, для профилактики и лечения тяжелых бактериальных инфекций, сепсиса, иммунодефицитных заболеваний. Такие препараты применяются энтерально, так как энтеральный способ введения имеет ряд преимуществ перед парэнтеральным, а именно простота применения; непосредственная доставка препарата в очаг поражения; возможность увеличения объема вводимого препарата; хорошая переносимость; возможность добавления в пищу. В России таким препаратом является комплексный иммуноглобулиновый препарат, который содержит иммуноглобулины трех основных классов IgA (15-25%), IgM (15-25%), IgG (50-75%)/ФС N 42-3347-97/.

Известен способ получения комплексного иммуноглобулинового препарата с использованием фосфата кальция и каприловой кислоты с дальнейшей обработкой на DEAE-Sephadex А-50 и бета-пропиолактоном.

Такой способ получения является сложным, многостадийным, требующим специализированного оборудования, а его использование возможно в основном только в лабораторных условиях /US 5.075.425/.

В 1995 г. был запатентован метод получения иммуноглобулинового препарата, содержащего более чем 5% IgM и 10% IgA, с помощью ионообменной хроматографии /US 5.410.025/.

Недостатками данного метода являются: низкое содержание IgM и IgA; высокая трудоемкость; возможность использования метода только в лабораторных условиях.

Существует способ получения иммуноглобулин-обогащенной фракции, содержащей IgG, IgM, IgA с использованием сульфата меди из сыворотки животных. Этот метод позволяет получить только коллоидный раствор, который может быть использован в ветеринарии /US 5.087.695/.

Известен метод получения фракции иммуноглобулинов G, М, А путем непрерывного электрофореза с предварительным спиртовым фракционированием плазмы крови. Он является трудоемким, его проведение возможно только при наличии специального оборудования, а полученный препарат является частично комбинированным /US 4.246.085/.

В литературе имеются сведения о получении фракции, содержащей иммуноглобулины А, М и G спиртовым осаждением сыворотки или плазмы крови с последующей обработкой гидроксидом алюминия /Патент DE 2.404.265/. Недостатком этого способа является то, что при фракционировании большая часть иммуноглобулинов удаляется с балластными примесями, а использование гидроoкиси алюминия требует трудоемкой работы по ее удалению из получаемого препарата. Кроме того, фракционирование этанолом оказывает денатурирующее воздействие на белковый раствор и вызывает дополнительную агрегацию иммуноглобулинов.

Существует метод получения гамма-глобулиновых препаратов с увеличенным содержанием IgA или IgM из осадка Б /III фракция по Кону/. Метод предусматривает обработку ацетатного экстракта осадка Б раствором соли цинка и этанола с последующим двойным осаждением фракции иммуноглобулинов полиэтиленгликолем и диализом для удаления солей цинка /US 3.808.189/.

Препараты, полученные указанным способом, не являются комплексными, так как обогащены только IgM или IgA.

Известен способ получения комплексного препарата, содержащего (40-50%) IgG, (15-20%) IgA и (20-25%) IgM (M. Steinbuch, 1973). Препарат получают из осадка Б /III фракция по Кону/ каприлатно-спиртовым фракционированием. Недостатком данного метода является то, что конечный продукт содержит значительную примесь бета-глобулинов, содержание которых превышает 3%, т.е. выше уровня их содержания в обычных препаратах иммуноглобулинов по принятым техническим условиям.

Следует также отметить, что применение этанола оказывает денатурирующее воздействие на белковый раствор и требует специального оборудования, обеспечивающего возможность работы при минусовых температурах.

Наиболее близким к заявленному является способ получения КИП для энтерального применения /RU 2084229/, включающий получение солевого экстракта из осадка Б /III фракции по Кону/ в 0,9%-ном растворе хлорида натрия (в десятикратном объеме), обработку экстракта хлороформом (конечная концентрация 10%) с целью удаления липопротеидов и последующее осаждение фракции иммуноглобулинов полиэтиленгликолем (конечная концентрация - 12%). Препарат, полученный по этому способу, содержит (50-75%) IgG, (15-25%) IgA и (15-25%) IgM, в нем обнаружены повышенные титры антител против ряда энтеробактерий и вирусов /ФС N 42-3347-97/.

Однако комплексный иммуноглобулиновый препарат, получаемый по методу, в котором в качестве основного фракционирующего агента используется хлороформ, экономически невыгоден. Длительная обработка хлороформом иммуноглобулиновой фракции неприемлема, так как приводит к потерям эффекторных функций иммуноглобулинов, снижению титра антител и полимеризации. Необходимо также отметить, что использование хлороформа требует специального оборудования, а высокая концентрация хлороформа оказывает токсическое действие на персонал. Поэтому целесообразно уменьшение концентрации и времени обработки иммуноглобулиновой фракции хлороформом, а при возможности и полная замена данного фракционирующего агента.

Задачей изобретения является повышение биологической активности целевого продукта путем увеличения содержания иммуноглобулина класса М, уменьшения примеси липопротеинов, сокращения времени контакта хлороформа и иммуноглобулинов; упрощение технологического процесса за счет уменьшения действующей концентрации токсичного агента - хлороформа и отсутствия процесса осаждения фракции иммуноглобулинов ПЭГом.

Поставленная задача осуществляется путем последовательной обработки экстракта осадка Б /III фракция по Кону/ 0,1-3%-ным хлороформом и сульфатом меди в концентрации от 0,1 до 2% при величине pH 6-8, а выделение целевого продукта осуществляют методом ультрафильтрации в присутствии комплексообразующих соединений.

Преимущества предлагаемого способа получения комплексного иммуноглобулинового препарата доказаны в специальной серии экспериментов.

Образцы препарата были проанализированы методами электрофореза, иммуноэлектрофореза. Содержание иммуноглобулинов определяли с помощью реакции преципитации и методом радиальной иммунодиффузии согласно методическим рекомендациям Чернохвостовой Е.В. и соавт., 1984. Количество ионов меди определяли в соответствии с ГФ XI. Определение титра антител против сальмонелл и шигелл осуществляли методом РПГА согласно ФС 422-3347-97. Для определения токсичности препарата использовали 5 белых мышей массой 18-20 г, которым вводили по 0,5 мл раствора препарата внутрижелудочно. Наблюдение за животными вели в течение 5 дней /ФС 42-3347-97/. Содержание общих липидов определяли с помощью "Bio-la-test" Lachema.

Установлено, что активность полученного препарата выше в 2-3 раза по сравнению с прототипом, в нем полностью отсутствуют следы фосгена и полиэтиленгликоля, так как содержание хлороформа снижено при проведении технологического процесса в 5-10 раз и полностью отсутствует полиэтиленгликоль как реагент. Содержание общих липидов в готовом препарате снизилось в 2-3 раза. Введение комплексообразующих соединений, таких как натриeвая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) или тритоном Х-100 позволяет полностью связать и удалить ионы меди, что приводит к повышению стабильности целевого продукта, разрушению возможно присутствующих вирусов.

Комплексный иммуноглобулиновый препарат получают следующим образом. Осадок Б экстрагируют в десятикратном объеме 0,9% раствора хлорида натрия при комнатной температуре с постоянным перемешиванием. После полной экстракции осадка осуществляется осаждение липопротеидов обработкой раствором 0,1-3%-ного хлороформа при перемешивании смеси в течение 5-10 мин. Снижение концентрации хлороформа и уменьшение времени его воздействия позволяет снизить негативные влияния этого агента на иммуноглобулины.

Балластные примеси удаляют методом центрифугирования в режиме 3000-6000 об/мин в течение 15-20 мин. Далее осуществляют обработку фракции иммуноглобулинов сульфатом меди с конечной концентрацией 0,1-2% в смеси, рН которой составляет 6-8.

Раствор центрифугируют и обрабатывают раствором ЭДТА в конечной концентрации (1-0,2)% для предотвращения влияния экстрагирующих агентов на белок и его стабилизации. Диализ для удаления низкомолекулярных примесей и концентрирования до содержания белка 6% осуществляют методом ультрафильтрации на ультрафильтрационной установке. В концентрат добавляют стабилизаторы, такие как глицин, глюкоза, мальтоза, для восстановления молекулярного биэлектрического слоя иммуноглобулинов, который может быть частично разрушен вследствие химического и физического воздействия. Стабилизированный препарат подвергают осветляющей и стерилизующей фильтрации, сублимационной сушке согласно производственному регламенту на комплексный иммуноглобулиновый препарат, сухой для энтерального применения (КИП) (введен 30 мая 1996 г.).

Обоснование выбранных параметров способа
Концентрация хлороформа 0,1-3% выбрана вследствие того, что последовательная обработка экстракта двумя различными осадителями позволяет значительно уменьшить содержание хлороформа в смеси. Диапазон содержания ионов меди в растворе объясняется тем, что при более низкой концентрации сульфата меди в растворе происходит неполное осаждение липопротеидов, при более высокой концентрации - частичная или полная денатурация белка, уменьшение выхода и снижение титра антител.

Анализ качества препарата, проведенный согласно ГФ XI и ФС 42-3347-97 на препарат КИП, доказывает преимущество заявленного способа (см. таблицу).

Анализ полученных препаратов позволяет выявить преимущества заявляемого способа получения КИП. Так, биологическая специфическая активность препарата была выше в 2 раза по сравнению с прототипом; содержание иммуноглобулина класса М увеличено в 2 раза; содержание общих липидов в готовом продукте более чем в 5 раз меньше по сравнению с прототипом.

Формула изобретения

Способ получения комплексного иммуноглобулинового препарата, включающий стадию экстрагирования осадка Б (III фракция по Кону) раствором хлористого натрия, удаление балластных примесей и выделение целевого продукта, отличающийся тем, что удаление балластных примесей осуществляют путем последовательной обработки экстракта хлороформом в концентрации от 0,1 до 3% и центрифугирования, и последующей обработки иммуноглобулиновой фракции для удаления липопротеидов сульфатом меди в концентрации от 0,1 до 2% при рН 6-8, а выделение целевого продукта осуществляют ультрафильтрацией в присутствии комплексообразующих соединений.

Изобретение "СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОГЛОБУЛИНОВОГО ПРЕПАРАТА" (Зорик А.В., Алешкин В.А.,Лютов А.Г.,Борисова И.В.) отмечено юбилейной наградой (25 лет Российской Академии Естествознания)
Медаль Альфреда Нобеля

Оформление наградных документов и заказ каталога