ВАКЦИННЫЙ ШТАММ ВИРУСА ГРИППА В/60/БРИСБЕН/08/83 ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ЖИВОЙ ГРИППОЗНОЙ ИНТРАНАЗАЛЬНОЙ ВАКЦИНЫ ДЛЯ ВЗРОСЛЫХ И ДЛЯ ДЕТЕЙ

Название	ВАКЦИННЫЙ ШТАММ ВИРУСА ГРИППА В/60/БРИСБЕН/08/83 ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ЖИВОЙ ГРИППОЗНОЙ ИНТРАНАЗАЛЬНОЙ ВАКЦИНЫ ДЛЯ ВЗРОСЛЫХ И ДЛЯ ДЕТЕЙ
Разработчик (Авторы)	Ларионова Наталья Валентиновна, Руденко Лариса Георгиевна, Александрова Галина Ибрагимовна
Вид объекта патентного права	Изобретение
Регистрационный номер	2422517
Дата регистрации	28.01.2010
Правообладатель	Учреждение Российской Академии медицинских наук Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Северо-западного отделения РАМН
Медаль имени А.Нобеля

Описание изобретения

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в здравоохранении для профилактики эпидемического гриппа среди взрослых и детей живой интраназальной гриппозной вакциной из штамма вируса гриппа В/60/Брисбен/08/83, семейства Orthomyxoviridae, рода Influenzavirus В.

Известный вакцинный штамм вируса гриппа - В/60/Джилин/03/1-прототип [Патент №2307161, гос. рег. 09.11.2005. БИ. №27, 27.09.2007 г.Руденко Л.Г., Александрова Г.И., Ларионова Н.В., Климов А.И. Штамм вируса гриппа В/60/Джилин/03/1 для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей] - утратил антигенную актуальность и вследствие этого не сможет вызвать защитную реакцию во время эпидемии гриппа, вызванной штаммом вируса гриппа, аналогичным вирусу В/Брисбен/60/2008.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение вакцинного штамма актуальной антигенной разновидности на основе эпидемического вируса В/Брисбен/60/2008.

Вакцинный штамм В/60/Брисбен/08/83 получен методом генетической реассортации эпидемического вируса В/Брисбен/60/2008 со штаммом В/СССР/60/69 - донором аттенуирующих свойств, с последующей селекцией в присутствии антисыворотки к вирусу В/СССР/60/69. Донор аттенуации - холодоадаптированный температурочувствительный штамм вируса гриппа В/СССР/60/69, разрешенный для получения безвредных живых интраназальных вакцин [Александрова Г.И., Климов А.И. Живая вакцина против гриппа. - СПб.: Наука. - 1994. - 151 с.].

В реакции торможения гемагглютинации (РТГА) установлена принадлежность гена, кодирующего поверхностный белок гемагглютинин (НА), вирусу В/Брисбен/60/2008, антисывороткой к которому полностью нейтрализуется.

Состав внутренних генов и гена, кодирующего нейраминидазу (NA), вакцинного штамма В/60/Брисбен/08/83 установлен методом рестрикционного анализа амплифицированных ДНК-копий генов. Рестрикционный метод [Klimov A.I., Сох N.J. PCR restriction analysis of genome composition and stability of cold-adapted reassortant live influenza vaccines // J.Virol. Methods. - 1995. - Vol.52. - №1-2. - P.41-49] основан на амплификации участков РНК длиной около 150-400 нуклеотидов, включающих уникальные нуклеотидные последовательности, характерные только для донора аттенуации, но не для современных эпидемических вирусов гриппа, или наоборот. Обработка амплифицированных фрагментов ДНК специфическими эндонуклеазами (рестриктазами) с последующим электрофорезом обработанных рестриктазами фрагментов ДНК в 1.7%-ном агарозном геле, в присутствии 0.5 мкг/мл этидиума бромида, позволяет четко дифференцировать принадлежность генов исследуемых реассортантных штаммов к эпидемическому вирусу или донору аттенуации. Нами были подобраны праймеры, позволяющие амплифицировать фрагменты ДНК-копий генов вируса, которые имеют специфичные для донора аттенуации В/СССР/60/69 и для современных эпидемических вирусов гриппа В последовательности. Подобран набор рестриктаз для специфичных последовательностей донора или эпидемического вируса гриппа В «викторианской» ветви, к которой относится эпидемический вирус В/Брисбен/60/2008 (таблица 1). Установлено, что вакцинный штамм В/60/Брисбен/08/83 унаследовал шесть генов, кодирующих внутренние негликозилированные белки (РВ1, РВ2, PA, NP, М, NS) от донора аттенуации В/СССР/60/69, и два гена, кодирующих поверхностные белки - НА и NA - от эпидемического вируса В/Брисбен/60/2008 (таблица 2).

ОЦЕНКУ ФЕНОТИПИЧЕСКИХ СВОЙСТВ вакцинного штамма В/60/Брисбен/08/83 проводили путем его параллельного титрования в РКЭ при разных температурах. Показано, что вакцинный штамм является температурочувствительным (разность в показателях инфекционной активности при температуре инкубации 32°C и 37°C составляет 7.0 lg ЭИД₅₀/0,2 мл) и холодоадаптированным (разность в показателях инфекционной активности при температуре инкубации 32°C и 25°C равна 2.5 lg ЭИД₅₀/0,2 мл), что свидетельствует о его безвредности для человека, поскольку по этим показателям он идентичен донору аттенуации В/СССР/60/69.

ОЦЕНКУ ТОКСИЧНОСТИ вакцинного штамма В/60/Брисбен/08/83 осуществляли путем подкожного и внутрибрюшинного введения вирусного материала мышам. Для этого группе из 10 мышей (самцов линии СВА весом 18-20 г) вводили соответствующим способом 0,5 мл вируссодержащей аллантоисной жидкости с титром 8.0 lg ЭИД₅₀/0,2 мл и оценивали патогенность вируса по проценту выживших мышей в течение 7 дней после введения вируса. Вакцинный штамм В/60/Брисбен/08/83 в эксперименте на мышах оказался полностью безвредным - 100% мышей выжили в течение всего периода наблюдения.

ОЦЕНКУ РЕАКТОГЕННОСТИ ДЛЯ ЛЮДЕЙ вакцинного штамма В/60/Брисбен/08/83 изучали при его интраназальном введении взрослым и детям.

Пример 1. Штамм В/60/Брисбен/08/83 ареактогенен для взрослых лиц.

При интраназальной вакцинации 48 взрослых лиц реассортантным вакцинным штаммом В/60/Брисбен/08/83 с инфекционной активностью 7.5 lg ЭИД₅₀/0,2 мл в разведении 1:2 в объеме 0.5 мл сильных, температурных реакций с повышением температуры тела свыше 38,5°C не наблюдалось. Средних реакций с кратковременным повышением температуры в диапазоне 37,6-38,5°C также не наблюдалось. Слабые температурные реакции (до 37,5°C) наблюдались в 6.3% случаев в группе привитых, тогда как в группе лиц, получивших плацебо (24 человека), такие реакции зарегистрированы в 8.3% случаев. Легкие катаральные явления, в виде насморка, отмечены у 1 человека (2.1%) среди вакцинированных и у троих лиц (12.5%) среди получивших плацебо. Прочих катаральных симптомов и интоксикации не наблюдалось. Показатель реактогенности (разница в проценте средних реакций у привитых вакциной и получивших плацебо) составил 0%. Результаты обследования приведены в таблице 3.

Пример 2. Штамм В/60/Брисбен/08/83 ареактогенен для детей 7-14 лет.

Группу из 20 детей в возрасте 7-14 лет вакцинировали интраназально в объеме 0.5 мл реассортантным вакцинным штаммом В/60/Брисбен/08/83 с инфекционной активностью 7.5 lg ЭИД₅₀/МЛ в разведении 1:2. Группа детей того же возраста из 21 человека получила плацебо. В группе вакцинированных детей сильных, средних и слабых температурных реакций не наблюдалось. Легкие катаральные явления, в виде насморка, отмечены у троих детей (15%). Интоксикации и прочих симптомов отмечено не было. В группе детей, получивших плацебо, сильных, средних и слабых температурных реакций также не наблюдалось. Катаральные симптомы отмечены у одного ребенка (4.8%). Показатель реактогенности составил 0%. Результаты исследований приведены в таблице 4.

Испытания на волонтерах подтвердили, что вакцинный штамм В/60/Брисбен/08/83 по показателям реактогенности соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам Фармакопейной статьей ФСП 42-0504-4097-04 на живую сухую гриппозную аллантоисную вакцину для интраназального применения.

Представленный вакцинный штамм В/60/Брисбен/08/83 характеризуется сочетанием полезных признаков, необходимых вакцинному штамму: антигенной специфичностью поверхностных белков эпидемического вируса В/Брисбен/60/2008, структурой генома, оптимальной для реассортантных вакцинных штаммов, температурочувствительностью и холодоадаптированностью, что коррелирует с аттенуацией для человека, характерной для донора аттенуации. Вакцинный штамм В/60/Брисбен/08/83 ареактогенен для взрослых и для детей при интраназальном введении. Штамм задепонирован в ФГУН «Государственный НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов имени Л.А.Тарасевича» Роспотребнадзора (ФГУН ГИСК им. Л.А.Тарасевича Роспотребнадзора) под №796.

Морфология штамма - полиморфная, типичная для вируса гриппа.

На основании вышесказанного предлагаемый вакцинный штамм вируса гриппа может быть использован для профилактики гриппа как у взрослых, так и у детей.

ХАРАКТЕРИСТИКА ВАКЦИННОГО ШТАММА ВИРУСА ГРИППА В/60/БРИСБЕН/08/83 СЕМЕЙСТВА ORTHOMYXOVIRIDAE, РОДА INFLUENZAVIRUS В

Инфекционная активность при репродукции в развивающихся куриных эмбрионах при 32-33°C в течение 72 часов - 8.0 lg ЭИД₅₀/0.2 мл.

Гемагглютинирующая активность - 1:1024.

Штамм проявляет генетическую стабильность биологических признаков после 5 пассажей на куриных эмбрионах (при использовании больших заражающих доз).

Характеристики вакцинного штамма В/60/Брисбен/08/83 представлены в прилагаемом паспорте. На основании этих характеристик штамм использовали в приготовлении вакцины и проверили вакцину на волонтерах.

ПАСПОРТ ШТАММА

1. Название штамма - В/60/Брисбен/08/83.

2. Серия - серия 1 (первая).

3. Метод получения - реассортация; характеристика родительских вирусов:

а) эпидемический вирус - В/Брисбен/60/2008;

б) донор аттенуации - В/СССР/60/69.

4. Количество пассажей - 5 в процессе реассортации.

5. Характеристика штамма до лиофилизации:

а) оптимальные условия репродукции - 32°C, 72 часа;

б) гемагглютинирующая активность - 1:512;

в) инфекционная активность - 8.0 lg ЭИД₅₀/0,2 мл;

г) чувствительность к ингибиторам - ингибитороустойчивый в РТГА с нормальной лошадиной сывороткой;

д) разность в показателях инфекционной активности при 32°C/37°C: 8.0 lg ЭИД₅₀/0,2 мл;

е) разность в показателях инфекционной активности при 32°C/25°C: 2.5 lg ЭИД₅₀/0,2 мл;

ж) структура генома реассортанта по данным рестрикционного анализа амплифицированных в RT-PCR фрагментов вирусных РНК:

гены от эпидемического вируса - HA, NA;

гены от донора аттенуации - РВ2, РВ1, PA, NP, M, NS.

6. Характеристика штамма после лиофилизации:

а) дата лиофилизации -10 апреля 2009 г.;

б) объем материала в ампуле - 1.0 мл;

в) количество доз в ампуле - 4;

г) инфекционная активность - 7,5 lg ЭИД₅₀/0.2 мл;

д) гемагглютинирующая активность - 1:256.

7. Рекомендуемое разведение при вакцинации - 1:2.

8. Антигенная специфичность гемагглютинина:

гемагглютинин в РТГА - идентичен вирусу В/Брисбен/60/2008, крысиной антисывороткой к которому полностью нейтрализуется.

9. Безвредность для мышей при подкожном и внутрибрюшинном введении - безвреден.

10. Бактериологический контроль: дата проведения - с 10 по 24 апреля 2006 г., результат - стерилен.

Формула изобретения

Штамм вируса гриппа В/60/Брисбен/08/83, депонированный в ФГУН «Государственный НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов имени Л.А.Тарасевича» Роспотребнадзора (ФГУН ГИСК им. Л.А.Тарасевича Роспотребнадзора) под №796, используемый для получения живой гриппозной интраназальной эпидемической вакцины для взрослых и для детей.

Изобретение "ВАКЦИННЫЙ ШТАММ ВИРУСА ГРИППА В/60/БРИСБЕН/08/83 ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ЖИВОЙ ГРИППОЗНОЙ ИНТРАНАЗАЛЬНОЙ ВАКЦИНЫ ДЛЯ ВЗРОСЛЫХ И ДЛЯ ДЕТЕЙ" (Ларионова Наталья Валентиновна, Руденко Лариса Георгиевна, Александрова Галина Ибрагимовна) отмечено юбилейной наградой (25 лет Российской Академии Естествознания)
Медаль Альфреда Нобеля

Оформление наградных документов и заказ каталога