ВАКЦИННЫЙ ШТАММ ВИРУСА ГРИППА В/60/ВИСКОНСИН/2010/125

Название	ВАКЦИННЫЙ ШТАММ ВИРУСА ГРИППА В/60/ВИСКОНСИН/2010/125
Разработчик (Авторы)	Баженова Екатерина Андреевна, Ларионова Наталья Валентиновна, Киселева Ирина Васильевна, Дубровина Ирина Анатольевна, Руденко Лариса Георгиевна, Александрова Галина Ибрагимовна
Вид объекта патентного права	Изобретение
Регистрационный номер	2545695
Дата регистрации	17.07.2012
Правообладатель	Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины" Северо-Западного отделения Российской Академии медицинских наук
Медаль имени А.Нобеля

Описание изобретения

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в практическом здравоохранении для профилактики заболеваемости гриппом среди взрослых и детей с помощью живой гриппозной интраназальной вакцины из штамма вируса гриппа типа В, семейства Orthomyxoviridae, рода Influenzavirus В, В/60/Висконсин/2010/125.

В результате появления в циркуляции нового эпидемического штамма вируса гриппа, принадлежащего к антигенной линии Ямагата - В/Висконсин/1/2010, известный вакцинный штамм В/60/Брисбен/08/83 антигенной линии Виктория - прототип [Патент РФ №2422517, опубл. 27.06.2011. БИ №18] - утратил антигенную актуальность и вследствие этого не может вызвать защитную реакцию во время эпидемии, вызванной В/Висконсин/1 /2010-подобными штаммами вируса гриппа.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение вакцинного штамма В/Висконсин/1/2010 для живой гриппозной вакцины на основе эпидемического вируса актуальной антигенной разновидности. Вакцина должна быть пригодна для взрослых и для детей, то есть соответствовать нормативным требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам Фармакопейной статьей ФСП Р№003224/01-050210 на живую гриппозную вакцину для интраназального применения. Для его подготовки были использованы два родительских штамма вируса гриппа: эпидемический штамм вируса гриппа линии Ямагата - В/Висконсин/1/2010 и безвредный для человека холодоадаптированный донор аттенуации В/СССР/60/69.

Применяемые в настоящее время штаммы для живых гриппозных вакцин получают методом генетической реассортации (рекомбинации) эпидемически актуальных вирусов с холодоадаптированными штаммами - донорами аттенуации [Александрова Г.И. Применение метода генетической рекомбинации для получения вакцинных штаммов вируса гриппа. Вопр. вирусол. 1977. №4. С.387-395].

Донор аттенуации В/СССР/60/69 - холодоадаптированный (ca) и температурочувствительный (ts) штамм вируса гриппа, разрешенный для получения безвредных живых интраназальных вакцин для взрослых и детей [Александрова Г.И. Новое в эпидемиологии и профилактике вирусных инфекций. Л.,1968. С.66-83]. Донор аттенуации В/СССР/60/69 был получен из эпидемического вируса гриппа В/СССР/69 методом холодовой адаптации [Александрова Г.И., Климов А.И. Живая вакцина против гриппа. СПб.: Наука. 1994. 151 с.], в результате чего он стал безвредным для человека, т.е. приобрел способность бессимптомно размножаться в верхних дыхательных путях привитых лиц, вызывая выработку полноценного противовирусного иммунитета.

Цель реассортации - получить штамм с вакцинной формулой генома 6:2. Обычно гены, кодирующие поверхностные белки вируса гриппа гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA), наследуются от антигенно актуального циркулирующего эпидемического (пандемического) штамма, а шесть генов, кодирующих внутренние и неструктурные белки (РВ2, РВ1, PA, NP, M, NS) - от безвредного донора аттенуации.

Важным в создании каждого нового вакцинного штамма является, чтобы этот новый по составу двух генов (гемагглютинина и нейраминидазы) штамм приобрел свойства, присущие вакцинным штаммам для живой гриппозной вакцины. Для этого необходимо получить чистый клон с формулой генома 6:2 с сочетанием следующих полезных признаков: температурочувствительность и холодоустойчивость репродукции в развивающихся куриных эмбрионах и аттенуацию (безвредность) для лабораторных животных.

Получение вакцинного штамма. Вакцинный штамм В/60/Висконсин/2010/125 получен методом генетической реассортации эпидемического вируса В/Висконсин/1/2010 с донором аттенуации В/СССР/60/69 путем одновременного инфицирования развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ) смесью родительских вирусов в эквивалентных инфекционных дозах, с последующей трехкратной селекцией клонов с заданными свойствами при пониженной до 25°С температуре инкубации в присутствии антисыворотки к донору аттенуации. Клоны дополнительно очищены пятикратным клонированием методом предельных разведений в присутствии антисыворотки к донору аттенуации при пониженной (25°С) и оптимальной (32°С) температурах инкубации. Чистые клоны проверены по фенотипическим характеристикам (ts- ca-фенотип) и по формуле генома на соответствие требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам.

Для анализа состава генома полученных реассортантов использовали следующие методы:

а) Реакцию торможения гемагглютинации (РТГА), позволяющую определить принадлежность поверхностного антигена - гемагглютинина (НА) одному из родительских вирусов, то есть установить специфичность вакцинного штамма [Методы определения показателей качества иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики гриппа. МУК 3.3.2.1758-03].

б) Микс-ПЦР анализ ДНК копий генов [Киселева И.В. с соавт. Анализ состава генома штаммов сезонной и пандемической живой гриппозной вакцины. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2011. №4. С.29-36], основанный на различиях в размерах соответствующих амплифицируемых фрагментов генов донора аттенуации или «дикого» вируса.

Для каждого фрагмента генома эпидемического штамма вируса гриппа В/Висконсин/1/2010 и донора аттенуации В/СССР/60/69 были подобраны пары праймеров, специфичных соответственно только для донора аттенуации или только для вируса «дикого» типа (табл.1).

Таким образом, «да-нет» результаты, регистрируемые в электрофорезе ПЦР-продуктов, позволяют четко установить принадлежность исследуемого гена и оценить степень чистоты вакцинного препарата.

Амплифицированные фрагменты ДНК визуализировали электрофорезом в 1.7%-ном агарозном геле, содержащем 0.5 мкг/мл этидиума бромида. Это позволило четко дифференцировать принадлежность генов исследуемого реассортантного штамма к эпидемическому вирусу гриппа В В/Висконсин/1/2010 или донору аттенуации В/СССР/60/69.

Антигенная характеристика вакцинного штамма. Гемагглютинин (НА) полученного авторами вакцинного штамма В/60/Висконсин/2010/125 в РТГА идентичен эпидемическому вирусу В/Висконсин/1/2010, антисывороткой к которому полностью нейтрализуется. Микс-ПЦР методом установлено, что вакцинный штамм В/60/Висконсин/2010/125 унаследовал нейраминидазу (NA) - от эпидемического вируса В/Висконсин/1/2010.

Таблица 1. Праймеры, использованные для анализа генома реассортантного вакцинного штамма В/60/Висконсин/2010/125, полученного при скрещивании эпидемического вируса гриппа В/Висконсин/1/2010 с донором аттенуации В/СССР/60/69.

Формула генома. Формула генома 6:2 вакцинного штамма В/60/Висконсин/2010/125 подтверждена методом микс-ПЦР с помощью специфических праймеров, то есть вакцинный штамм В/60/Висконсин/2010/125 унаследовал шесть генов, кодирующих внутренние белки (РВ2, РВ1, PA, NP, М, NS), от донора аттенуации В/СССР/60/69, а гены, кодирующие поверхностные белки (НА, NA) - от эпидемического вируса В/Висконсин/1/2010. Доказательством получения вакцинного штамма с заданной формулой генома служат результаты микс-ПЦР, приведенные на фиг.1 и в таблице 2.

На фиг.1 в качестве примера представлен электрофорез в 1.7%-ном агарозном геле, содержащем 0.5 мкг/мл этидиума бромида, амплифицированных фрагментов гена, кодирующего нейраминидазу (NA). 1-я дорожка - маркер молекулярного веса; 2-я дорожка - NA эпидемического вируса гриппа В/Висконсин/1/2010 с праймерами, специфичными для донора аттенуации В/СССР/60/69; 3-я и 8-я дорожки - NA эпидемического вируса гриппа В/Висконсин/1/2010 с праймерами, специфичными для эпидемического вируса гриппа В/Висконсин/1/2010; 4-я дорожка - NA вакцинного штамма В/60/Висконсин/2010/125 с праймерами, специфичными для эпидемического вируса гриппа В/Висконсин/1/2010; 5-я и 7-я дорожки - NA донора аттенуации В/СССР/60/69 с праймерами, специфичными для донора аттенуации В/СССР/60/69; 6-я дорожка - NA донора аттенуации В/СССР/60/69 с праймерами, специфичными для эпидемического вируса гриппа В/Висконсин/1/2010.

Микс-ПЦР позволил четко установить принадлежность гена, кодирующего нейраминидазу исследуемого реассортантного вакцинного штамма, к эпидемическому вирусу гриппа В В/Висконсин/1/2010.

Результаты анализа всех генов вакцинного штамма В/60/Висконсин/2010/125 представлены в табл.2.

Оценку фенотипических свойств вакцинного штамма В/60/Висконсин/2010/125 проводили путем его параллельного титрования в РКЭ при разных температурах. Вакцинный штамм В/60/Висконсин/2010/125 в развивающихся куриных эмбрионах обладает выраженным температурочувствительным и холодоадаптированным фенотипом, идентичным фенотипу донора аттенуации В/СССР/60/69. Установлено, что вакцинный вирус является температурочувствительным (ts фенотип) - его инфекционная активность при температуре 38°С составила<1.7 log₁₀ ЭИД₅₀/мл, и холодоадаптированным (са фенотип) - инфекционная активность при пониженной до 26°С температуре инкубации составила 6.2 log₁₀ ЭИД₅₀/мл, что свидетельствует о его безвредности для человека, поскольку по этим показателям он идентичен донору аттенуации В/СССР/60/69. Фенотипические свойства вакцинного штамма В/60/Висконсин/2010/125 не изменились после его пятикратного пассирования при использовании больших заражающих доз, что свидетельствует о генетической стабильности препарата (табл.3).

Оценку токсичности (безвредность для лабораторных животных) вакцинного штамма В/60/Висконсин/2010/125 проводили в соответствии с Руководством по доклиническому изучению новых фармакологических веществ [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под общей редакцией Р.У.Хабриева. - М., 2005. - 832 с.] путем внутрибрюшинного введения вирусного материала мышам. Для этого группе из 20 мышей (самцов и самок линии СВА весом 18-20 г.) вводили внутрибрюшинно 0,5 мл вируссодержащей аллантоисной жидкости с титром 8.0 lg ЭИД₅₀/мл и оценивали патогенность вируса по проценту выживших мышей в течение 14 дней после введения вируса. Животным контрольной группы вводили плацебо - физиологический раствор. Вакцинный штамм В/60/Висконсин/2010/125 в эксперименте на мышах оказался полностью безвредным -100% мышей выжили в течение всего периода наблюдения. Отмечена прибавка в весе животных при их 100%-ной выживаемости (табл.4).

В результате проведенных доклинических исследований установлено, что заявляемый вакцинный штамм живой гриппозной вакцины В/60/Висконсин/2010/125 характеризуется сочетанием полезных признаков, необходимых вакцинному штамму: антигенной специфичностью эпидемического вируса В/Висконсин/1/2010, структурой генома 6:2, оптимальной для реассортантных вакцинных штаммов, генетической стабильностью, а также характерной для донора аттенуации температурочувствительностью и холодоадаптированностью, что коррелирует с аттенуацией для человека. Штамм аттенуирован и безвреден для мышей.

Морфология штамма полиморфная, типичная для вируса гриппа.

Все это отражено в прилагаемом ниже Паспорте штамма.

Таким образом, вакцинный штамм В/60/Висконсин/2010/125 по биологическим свойствам соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам Фармакопейной статьей ФСП Р№003224/01-050210 на живую гриппозную вакцину для интраназального применения для взрослых и для детей и действующему Приказу Минздрава РФ от 07.08.1998 №156/79 «О подготовке новых вакцинных производственных и диагностических штаммов вируса гриппа и их внедрении в производство вакцин и диагностических препаратов».

Полученный штамм В/60/Висконсин/2010/125 депонирован 31.10.2011 в Государственную коллекцию вирусов ФГБУ «Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И.Ивановского» Минздравсоцразвития России (ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского Минздравсоцразвития России, Россия RU, 123098, город Москва, улица Гамалеи, 16) под №2723 и имеет характеристики, представленные в паспорте штамма.

ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММА

Инфекционная активность штамма В/60/Висконсин/2010/125 при репродукции в развивающихся куриных эмбрионах при 32°С в течение 72 часов - 8.7 log₁₀ ЭИД₅₀/мл. Гемагглютинирующая активность - 1:128.

Штамм проявляет генетическую стабильность фенотипических признаков после 5 пассажей на куриных эмбрионах (при использовании больших заражающих доз).

Полезным свойством вакцинного штамма вируса гриппа В/60/Висконсин/2010/125 является его пригодность для наработки живой гриппозной вакцины. Предлагаемый по изобретению вакцинный штамм вируса гриппа В/60/Висконсин/2010/125 может быть использован для профилактики гриппа как у взрослых, так и у детей с трехлетнего возраста.

ПАСПОРТ ШТАММА

1. Название штамма: В/60/Висконсин/2010/125

2. ИЭМ идентификационный №: BW/125/105/817

3. Серия: №1

4. Тип/подтип: линия Ямагата

5. Метод подготовки: классическая реассортация в куриных эмбрионах

6. Родительские вирусы

6.1. Эпидемический вирус: В/Висконсин/1/2010; CDC ID# 2010730255

6.2. Донор аттенуации: В/СССР/60/69

7. Число пассажей в процессе реассортации:

Е9 (скрещивание, три селективных пассажа и пять клонирований предельными разведениями)

8. Состав генома: Гены РВ2, РВ 1, PA, NP, М и NS - от донора аттенуации;гены НА и NA - от эпидемического вируса (формула генома 6:2)

9. Характеристика штамма до лиофилизации

9.1. Оптимальные условия репродукции: 32°С, 72 часа

9.2. Гемагглютинирующая активность: 1:128 с 1.0% куриными эритроцитами

9.3. Инфекционная активность при оптимальной температуре 32°С: 8.7 log₁₀ ЭИД₅₀/мл

9.4. Чувствительность к неспецифическим γ-ингибиторам сыворотки крови лошади и морской свинки: чувствителен

9.5. ts маркер (температурочувствительность репродукции; инфекционная активность при температуре 38°С):<1.7 lg ЭИД₅₀/мл (ts фенотип)

9.6 са маркер (холодоустойчивость репродукции; инфекционная активность при температуре 26°С): 6.2 lg ЭИД₅₀/мл (са фенотип).

10. Характеристика штамма после лиофилизации

10.1. Объем материала в ампуле: 0.5 мл

10.2. Инфекционная активность при оптимальной температуре 32°С: 7.7 log₁₀ ЭИД₅₀/мл

10.3. Гемагглютинирующая активность: 1:64 с 1.0% куриными эритроцитами

11. Антигенная специфичность

11.1. Гемагглютинин: идентичен вирусу В/Висконсин/1/2010 по данным РТГА

11.2. Нейраминидаза: идентична вирусу В/Висконсин/1 /2010 по данным микс-ПЦР

12. Токсикологические исследования in vivo (острая токсичность):

Не токсичен после внутрибрюшинного заражения мышей

13. Контроль стерильности:

Стерилен

14. Контроль на присутствие посторонних вирусов:

Посторонние вирусы отсутствуют

Формула изобретения

Вакцинный штамм вируса гриппа В/60/Висконсин/2010/125, задепонированный в Государственную коллекцию вирусов ФГБУ «Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И.Ивановского» Минздравсоцразвития России под №2723, предназначенный для получения живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей.

Изобретение "ВАКЦИННЫЙ ШТАММ ВИРУСА ГРИППА В/60/ВИСКОНСИН/2010/125" (Баженова Екатерина Андреевна, Ларионова Наталья Валентиновна, Киселева Ирина Васильевна, Дубровина Ирина Анатольевна, Руденко Лариса Георгиевна, Александрова Галина Ибрагимовна) отмечено юбилейной наградой (25 лет Российской Академии Естествознания)
Медаль Альфреда Нобеля

Оформление наградных документов и заказ каталога