ШТАММ ВИРУСА ГРИППА В/60/Пхукет/2013/26 ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ЖИВОЙ ГРИППОЗНОЙ ИНТРАНАЗАЛЬНОЙ ВАКЦИНЫ ДЛЯ ВЗРОСЛЫХ И ДЛЯ ДЕТЕЙ

Название	ШТАММ ВИРУСА ГРИППА В/60/Пхукет/2013/26 ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ЖИВОЙ ГРИППОЗНОЙ ИНТРАНАЗАЛЬНОЙ ВАКЦИНЫ ДЛЯ ВЗРОСЛЫХ И ДЛЯ ДЕТЕЙ
Разработчик (Авторы)	Киселева Ирина Васильевна, Крутикова Елена Витальевна, Дубровина Ирина Анатольевна, Кузнецова Виктория Аркадьевна, Баженова Екатерина Андреевна, Ларионова Наталья Валентиновна, Руденко Лариса Георгиевна
Вид объекта патентного права	Изобретение
Регистрационный номер	2605926
Дата регистрации	09.06.2015
Правообладатель	Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Институт экспериментальной медицины"
Медаль имени А.Нобеля

Описание изобретения

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в практическом здравоохранении для профилактики гриппа среди взрослых и детей с помощью живой гриппозной интраназальной вакцины из штамма вируса гриппа типа В, семейства Orthomyxoviridae, рода Influenzavirus В, В/60/Пхукет/2013/26.

В результате появления в циркуляции нового эпидемического штамма вируса гриппа, принадлежащего к антигенной линии Ямагата, - В/Пхукет/3073/2013, известный вакцинный штамм В/60/Висконсин/2010/125 антигенной линии Ямагата - прототип [Баженова Е.А., Ларионова Н.В., Киселева И.В., Дубровина И.А., Руденко Л.Г., Александрова Г.И. Вакцинный штамм вируса гриппа В/60/Висконсин/2010/125. Патент РФ №2545695. Опубл. 27.01.14. БИ №3] - утратил антигенную актуальность и вследствие этого не может вызвать защитную реакцию во время эпидемии, вызванной В/Пхукет/3073/2013-подобными штаммами вируса гриппа.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение вакцинного штамма для живой гриппозной вакцины актуальной антигенной разновидности на основе эпидемического вируса В/Пхукет/3073/2013. Вакцина должна быть пригодна для взрослых и для детей, то есть соответствовать нормативным требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам Фармакопейной статьей (ФСП: Р N 003224/01-270313) на Ультравак®, вакцину гриппозную аллантоисную живую для интраназального применения для взрослых и для детей.

Для подготовки вакцинного штамма были использованы два родительских вируса гриппа: эпидемический штамм вируса гриппа линии Ямагата - В/Пхукет/3073/2013 и безвредный для человека холодоадаптированный донор аттенуации В/СССР/60/69.

Применяемые в настоящее время штаммы для живых гриппозных вакцин получают методом генетической реассортации эпидемически актуальных вирусов с холодоадаптированными донорами аттенуации [Александрова Г.И. Применение метода генетической рекомбинации для получения вакцинных штаммов вируса гриппа. Вопр. вирусол. 1977. №4. С. 387-395].

Донор аттенуации В/СССР/60/69 - холодоадаптированный (са) и температурочувствительный (ts) штамм вируса гриппа, разрешенный для получения безвредных живых интраназальных вакцин для взрослых и детей [Александрова Г.И. Новое в эпидемиологии и профилактике вирусных инфекций. Л., 1968. С. 66-83]. Донор аттенуации В/СССР/60/69 был получен из эпидемического вируса гриппа В/СССР/69 методом холодовой адаптации [Александрова Г.И., Климов А.И. Живая вакцина против гриппа. СПб.: Наука. 1994. 151 с.], в результате чего он стал безвредным для человека, т.е. приобрел способность бессимптомно размножаться в верхних дыхательных путях привитых лиц, вызывая выработку полноценного противовирусного иммунитета.

Цель реассортации - получить штамм с вакцинной формулой генома 6:2. Гены, кодирующие поверхностные белки вируса гриппа гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA), наследуются от антигенно актуального циркулирующего эпидемического (пандемического) штамма, а шесть генов, кодирующих внутренние и неструктурные белки (РВ2, РВ1, PA, NP, М, NS), - от безвредного для человека донора аттенуации.

Получение вакцинного штамма. Вакцинный штамм В/60/Пхукет/2013/26 получен методом генетической реассортации эпидемического вируса В/Пхукет/3073/2013 с донором аттенуации В/СССР/60/69 путем одновременного инфицирования развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ) смесью родительских вирусов в эквивалентных инфекционных дозах, с последующей трехкратной селекцией клонов с заданными свойствами при пониженной до 26°С температуре инкубации в присутствии антисыворотки к донору аттенуации. Клоны дополнительно очищены тремя последовательными клонированиями методом предельных разведений в присутствии антисыворотки к донору аттенуации при пониженной (26°C) и оптимальной (32°C) температурах инкубации. Чистый клон проверен по фенотипическим характеристикам (ts-са-фенотип) и по формуле генома на соответствие требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам. Общее число пассажей при подготовке вакцинного штамма составило 6, после чего произведен один дополнительный накопительный пассаж (Е6/Е1).

Для анализа состава генома полученных реассортантов использовали:

(1) реакцию торможения гемагглютинации (РТГА), позволяющую определить принадлежность поверхностного антигена - гемагглютинина (НА) одному из родительских вирусов, то есть установить специфичность вакцинного штамма [Методы определения показателей качества иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики гриппа. МУК 3.3.2.1758-03];

(2) микс-ПЦР анализ ДНК копий генов [Киселева И.В. с соавт. Анализ состава генома штаммов сезонной и пандемической живой гриппозной вакцины. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2011. №4. С. 29-36], основанный на различиях в размерах соответствующих амплифицируемых фрагментов генов донора аттенуации или «дикого» вируса. Для каждого фрагмента генома эпидемического штамма вируса гриппа В/Пхукет/3073/2013 и донора аттенуации В/СССР/60/69 были использованы пары праймеров, специфичных соответственно только для донора аттенуации или только для вируса «дикого» типа [Киселева И.В. с соавт. Анализ состава генома штаммов сезонной и пандемической живой гриппозной вакцины. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2011. №4. С. 29-36] (табл. 1). Таким образом, «да-нет» результаты, регистрируемые в электрофорезе ПЦР-продуктов, позволяют четко установить принадлежность исследуемого гена и оценить степень чистоты вакцинного препарата.

Амплифицированные фрагменты ДНК визуализировали электрофорезом в 1,7%-ном агарозном геле, содержащем 0,5 мкг/мл этидиума бромида. Это позволило четко дифференцировать принадлежность генов исследуемого реассортантного штамма к эпидемическому вирусу гриппа В/Пхукет/3073/2013 или донору аттенуации В/СССР/60/69;

(3) полногеномное секвенирование с использованием набора BigDye Terminator v3.1 и секвенатора 3130x1 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA) в соответствии с инструкциями производителя. Для анализа данных секвенирования использовался программный пакет Lasergene 7.1.

Антигенная характеристика вакцинного штамма. Гемагглютинин (НА) полученного авторами вакцинного штамма В/60/Пхукет/2013/26 в РТГА идентичен эпидемическому вирусу В/Пхукет/3073/2013, антисывороткой к которому полностью нейтрализуется. Микс-ПЦР методом установлено и подтверждено секвенированием, что вакцинный штамм В/60/Пхукет/2013/26 унаследовал нейраминидазу (NA) - от эпидемического вируса В/Пхукет/3073/2013.

Формула генома. Формула генома 6:2 вакцинного штамма В/60/Пхукет/2013/26 подтверждена методом микс-ПЦР с помощью специфических праймеров [Киселева И.В. с соавт. Анализ состава генома штаммов сезонной и пандемической живой гриппозной вакцины. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2011. №4. С. 29-36] и секвенированием, то есть вакцинный штамм В/60/Пхукет/2013/26 унаследовал шесть генов, кодирующих внутренние белки (РВ2, РВ1, PA, NP, М, NS), от донора аттенуации В/СССР/60/69, а гены, кодирующие поверхностные белки (НА, NA) - от эпидемического вируса В/Пхукет/3073/2013. Доказательством получения вакцинного штамма с заданной формулой генома служат результаты микс-ПЦР и секвенирования, приведенные в табл. 2.

Секвенирование позволило четко установить принадлежность гена, кодирующего нейраминидазу исследуемого реассортантного вакцинного штамма, к эпидемическому вирусу гриппа В/Пхукет/3073/2013.

Результаты анализа всех генов вакцинного штамма В/60/Пхукет/2013/26 представлены в табл. 2.

Оценку фенотипических свойств вакцинного штамма В/60/Пхукет/2013/26 проводили путем его параллельного титрования в РКЭ при разных температурах. Вакцинный штамм В/60/Пхукет/2013/26 обладает: (1) высокой репродуктивной активностью, реплицируясь в РКЭ при оптимальной температуре инкубации до 8,7 log₁₀ ЭИД₅₀/мл; (2) выраженным температурочувствительным (ts) фенотипом - его инфекционная активность при температуре 38°C составила <0,7 log₁₀ ЭИД₅₀/мл, и (3) холодоадаптированным (са) фенотипом - инфекционная активность при пониженной до 26°C температуре инкубации составила 5,9 log₁₀ ЭИД₅₀/мл. Таким образом, ts/ca фенотип вакцинного штамма В/60/Пхукет/2013/26 идентичен фенотипу донора аттенуации В/СССР/60/69, что свидетельствует о его безвредности для человека.

Фенотипические свойства вакцинного штамма В/60/Пхукет/2013/26 не изменились после его пятикратного пассирования при использовании больших заражающих доз, что свидетельствует о генетической стабильности препарата (табл. 3).

Оценку токсичности (безвредность для лабораторных животных) вакцинного штамма В/60/Пхукет/2013/26 проводили в соответствии с Руководством по доклиническому изучению новых фармакологических веществ [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ (под общей редакцией Р.У. Хабриева). - М., 2005. - 832 с.], с Методическими рекомендациями по доклиническим испытаниям эффективности и безопасности новых иммунобиологических лекарственных препаратов [Методические рекомендации «Доклинические испытания эффективности и безопасности новых иммунобиологических лекарственных препаратов». - М., - 2010. - 39 с.] и с «Правилами лабораторной практики» [Правила лабораторной практики. Приказ Минздрава РФ №708 н от 23.08.2010. http://docs.cntd.ru/document/901866938].

Изучение острой токсичности препарата при однократном введении вирусного материала с использованием плацебо контроля (физиологический раствор). Морским свинкам подкожно вводили вирус в объеме 5,0 мл вируссодержащей аллантоисной жидкости с титром 8,7 log₁₀ ЭИД₅₀/мл на животное (доза эквивалентна 10 дозам, применяемым для человека) и оценивали выживаемость лабораторных животных. Контрольным животным вводили эквивалентное количество препарата плацебо - физиологический раствор. Каждая экспериментальная группа состояла из 20 морских свинок.

В течение исследования каждое животное осматривалось ежедневно. Осмотр включал в себя оценку общего поведения и общего состояния животных. При введении препарата осмотр проводился через 2 часа после инъекции. Пальпации подлежали места инъекций (для оценки местного раздражающего действия препарата), а также зрительно выявляемые патологические образования.

В результате исследования показано, что однократное введение вакцинного штамма в объеме, максимально возможном для введения животным данного вида, не вызывало гибели экспериментальных животных, изменения внешнего вида, подвижности, поведенческих реакций, потребления пищи и воды (табл. 4).

Изучение подострой токсичности вакцинного штамма при двукратном введении вирусного материала с использованием плацебо контроля (физиологический раствор)

Вакцинный препарат вводили интраназально, ежедневно в течение 2 дней, в объеме 0,5 мл на свинку, по 0,25 мл в каждый носовой ход, доза эквивалентна 1 дозе, применяемой для человека). Контрольным животным вводили физиологический раствор в эквивалентном объеме. Каждая экспериментальная группа состояла из 20 морских свинок. Ежедневно в течение всего исследования проводился контроль общего состояния каждого животного.

Данные физиологического исследования также показали, что двукратное введение вакцинного штамма не вызывало гибели экспериментальных животных и не приводило к изменению внешнего вида, поведения морских свинок, не отражалось на потреблении ими пищи и воды (табл. 4).

В результате проведенных доклинических исследований установлено, что заявляемый вакцинный штамм живой гриппозной вакцины В/60/Пхукет/2013/26 характеризуется сочетанием полезных признаков, необходимых вакцинному штамму: антигенной специфичностью эпидемического вируса В/Пхукет/3073/2013, структурой генома 6:2, оптимальной для реассортантных вакцинных штаммов, а также характерной для донора аттенуации температурочувствительностью и холодоадаптированностью и безвредностью для лабораторных животных, что коррелирует с аттенуацией для человека.

Образец паспорта на вакцинный штамм В/60/Пхукет/2013/26 прилагается.

Таким образом, вакцинный штамм В/60/Пхукет/2013/26 по своим биологическим свойствам соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам Фармакопейной статьей (ФСП: Р N 003224/01-270313) на Ультравак^®, вакцину гриппозную аллантоисную живую для интраназального применения для взрослых и для детей.

Полученный штамм В/60/Пхукет/2013/26 депонирован 11.12.2014 под №2808 в Государственную коллекцию вирусов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского (ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, Россия RU, 123098, г. Москва, ул. Гамалеи, 16) и имеет характеристики, представленные в образце паспорта штамма.

Характеристика штамма

Инфекционная активность штамма В/60/Пхукет/2013/26 при репродукции в развивающихся куриных эмбрионах при 32°C в течение 72 часов - 8,7 log₁₀ ЭИД₅₀/мл.

Гемагглютинирующая активность - 1:64.

Штамм проявляет генетическую стабильность фенотипических признаков после 5 пассажей на куриных эмбрионах (при использовании больших заражающих доз).

Полезным свойством вакцинного штамма вируса гриппа В/60/Пхукет/2013/26 является его пригодность для наработки живой гриппозной вакцины. Предлагаемый по изобретению вакцинный штамм вируса гриппа В/60/Пхукет/2013/26 может быть использован для профилактики гриппа как у взрослых, так и у детей с трехлетнего возраста.

Формула изобретения

Штамм вируса гриппа В/60/Пхукет/2013/26, депонированный в Государственную коллекцию вирусов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского (ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, Россия RU, 123098, г. Москва, ул. Гамалеи, 16) под №2808, используемый для получения живой гриппозной интраназальной гриппозной вакцины для взрослых и для детей.

Изобретение "ШТАММ ВИРУСА ГРИППА В/60/Пхукет/2013/26 ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ЖИВОЙ ГРИППОЗНОЙ ИНТРАНАЗАЛЬНОЙ ВАКЦИНЫ ДЛЯ ВЗРОСЛЫХ И ДЛЯ ДЕТЕЙ" (Киселева Ирина Васильевна, Крутикова Елена Витальевна, Дубровина Ирина Анатольевна, Кузнецова Виктория Аркадьевна, Баженова Екатерина Андреевна, Ларионова Наталья Валентиновна, Руденко Лариса Георгиевна) отмечено юбилейной наградой (25 лет Российской Академии Естествознания)
Медаль Альфреда Нобеля

Оформление наградных документов и заказ каталога