СПОСОБ КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ КЛЕТОЧНОГО МАТЕРИАЛА В ЭКССУДАТАХ ДЛЯ ЦИТОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ

Название	СПОСОБ КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ КЛЕТОЧНОГО МАТЕРИАЛА В ЭКССУДАТАХ ДЛЯ ЦИТОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ
Разработчик (Авторы)	Леонов Михаил Генрихович, Новик Виктор Иванович, Беляева Софья Александровна, Ершова Янина Хаим-Беньяминовна
Вид объекта патентного права	Изобретение
Регистрационный номер	2663926
Дата регистрации	13.08.2018
Правообладатель	Государственное бюджетное учреждение здравоохранения "Онкологический диспансер N 3" министерства здравоохранения Краснодарского края
Область применения (класс МПК)	G01N 33/48 (2006.01)

Описание изобретения

Изобретение относится к области медицины, в частности к диагностике физиологических состояний человеческого организма путем исследования биологического материала (асцитического и плеврального экссудатов) in vitro для цитологического и иммуноцитохимического исследований. Изобретение может быть использовано в онкологии, гинекологии, терапии, фтизиатрии и клинической лабораторной диагностике.

Основным условием первичной диагностики злокачественных новообразований, при наличии асцита и/или плеврита, является достаточное количество клеточного материала в экссудате для проведения цитологического исследования. Несмотря на большие достижения в цитологической диагностике, особенно за последние годы, исследование экссудатов является сложной диагностической задачей [4 стр. 5]. Злокачественные клетки в экссудатах плевральных и абдоминальных полостей не всегда удается обнаружить даже при поздних стадиях заболевания в силу недостаточного количества клеток в исследуемом материале. А своевременное установление распространенности опухолевого процесса, до появления клинических проявлений заболевания, имеет немаловажное значение для правильного выбора и своевременного начала лечения. Точность традиционного цитологического исследования экссудатов брюшной и плевральных полостей составляет не более 60%, что крайне недостаточно для установления правильного морфологического диагноза при злокачественных новообразованиях [3 стр. 53]. Основной причиной, обуславливающей невысокую достоверность исследования, является недостаточное количество клеточного материала в исследуемом экссудате.

Известен традиционный способ концентрации клеток в экссудатах, который заключается в повторном центрифугировании. Если при центрифугировании прозрачной серозной жидкости осадок образуется незначительный или он совсем не определяется, то на осадок, образовавшийся при центрифугировании первой порции экссудата, наливают до 5–6 порций выпота и повторно центрифугируют. Это трудоемкая процедура и не всегда позволяет получить в цитологических препаратах достаточное количество клеток, необходимое для морфологической диагностики злокачественных новообразований [2 стр. 8–9].

Известен способ седиментации, который заключается в осаждении дисперсной фазы из дисперсионной среды под действием силы тяжести для концентрирования дисперсионной фазы [1 стр. 338–339]. Этот способ применяется в том числе для разделения дисперсионной системы. Несмотря на то, что экссудат является дисперсионной системой, способ седиментации не используется для концентрирования клеточного материала в выпотных жидкостях при проведении цитологических исследований.

Цель изобретения – повышение точности цитологической диагностики злокачественных новообразований.

Для достижения указанной цели предложен cпособ концентрирования клеточного материала в экссудатах для цитологического исследования злокачественных новообразований, характеризующийся тем, что получают экссудат путем лапароцентеза или пневмоцентеза, добавляют к нему раствор антикоагулянта цитрата натрия 5% в соотношении 10:1, центрифугируют его, переносят клеточный осадок на предметное стекло и проводят цитологическое исследование с учетом того, что при больших объемах экссудата (до 500–1500 мл) собирают три порции – в начале, в середине и в конце пункции, смешивают объемы всех трех порций и используют для исследования 500–600 мл, а при малых объемах экссудата (до 500 мл) собирают весь объем экссудата, далее переносят экссудат в капельную воронку и отстаивают в течение 60 минут до образования обогащенного придонного слоя, после чего переносят 20–50 мл придонного обогащенного слоя экссудата из капельной воронки в центрифужные пробирки и центрифугируют, сливают надосадочную жидкость и переносят концентрированный клеточный осадок на предметное стекло, при этом время центрифугирования для получения концентрированного клеточного осадка составляет не более 10 минут при скорости центрифугирования 2000 об/мин.

Заявляемое изобретение направлено на решение задачи получения оптимальных цитологических препаратов из абдоминального и/или плеврального экссудатов для обеспечения достаточного количества клеточных образцов для рутинной цитологической диагностики злокачественных новообразований, а в сложных диагностических случаях – получение монослойных препаратов методом жидкостной цитологии и использование их для иммуноцитохимической диагностики, имеющей важное значение в определении гистогенеза опухоли, ее дифференцировки и органной принадлежности.

Технический результат заключается в том, что из экссудата брюшной и/или плевральной полостей получают сконцентрированный клеточный осадок выпотной жидкости, из которого готовят традиционные цитологические препараты и жидкостные монослойные препараты для диагностики злокачественных новообразований. В сложных диагностических случаях монослойные препараты используются для проведения иммуноцитохимического исследования и определения гистогенеза опухоли, ее органной принадлежности и степени дифференцировки.

Сущность заявляемого изобретения заключается в том, что цитологические препараты, приготовленные из обогащенного придонного слоя экссудата, в отличие от препаратов, имеющих клеточный осадок, полученный путем центрифугирования выпотной жидкости, содержат большее количество клеточного материала за счет предварительного осаждения большего количества клеток и это способствует повышению точности цитологического исследования.

В таблице 1 представлены данные о количестве клеточного материала в 24 порциях экссудатов в зависимости от экспозиции времени его отстаивания (15, 30, 45, 60 и 90 минут).

Таблица 1

Количество клеточного материала в экссудате в зависимости от экспозиции времени отстаивания

Через 15 минут отстаивания среднее количество клеток в 24 исследуемых образцах экссудатов составило 48,0 в поле зрения, через 30 минут – 59,7, через 45 минут – 75,4, через 60 минут – 103,5, через 90 минут – 107,8 в поле зрения. На ФИГ. 1 представлена кривая осаждения клеточных образцов экссудатов в зависимости от экспозиции времени отстаивания.

При экспозиции времени отстаивания экссудата 60 минут количество клеточных образцов больше в 1,7 раза (на 73,3%), чем при экспозиции времени отстаивания 30 минут. Дальнейшее увеличение времени экспозиции не имеет значимого увеличения клеточных образцов в исследуемых экссудатах.

Таким образом, использование капельной воронки для концентрирования клеточного материала экссудатов в придонном слое выпотной жидкости и экспозиция времени отстаивания экссудата 60 минут являются оптимальными для получения качественных микропрепаратов, содержащих достаточное количество клеточного материала для цитологического исследования.

Использование в клинической онкологической, гинекологической, терапевтической, фтизиатрической и лабораторной практиках заявляемого способа обеспечивает повышение точности цитологической диагностики злокачественных новообразований.

Применяемая в данном способе технология концентрирования клеточного материала в экссудатах обеспечивает:

– возможность получения цитологических препаратов, содержащих достаточное количество клеточных образцов для цитологического и иммуноцитохимического исследований, что значительно снижает количество неудовлетворительных препаратов;

– сокращение времени и повышение производительности исследования;

– повышение точности цитологической диагностики злокачественных новообразований и рецидивов заболевания после проведенного лечения у больных с наличием серозных выпотов.

Преимущество изобретения заключается в том, что микропрепараты, полученные из концентрированного клеточного материала экссудатов, содержат достаточное количество клеток и тем самым способствуют повышению точности цитологического исследования.

Способ реализуется следующим образом: материалом для цитологического исследования служили экссудаты плевральной и брюшной полостей; при наличии выпота в плевральной или брюшной полостях, установленных с помощью лучевых методов диагностики (РКТ, МРТ, УЗИ и рентгенологического исследования), выполняли пункцию брюшной или плевральной полостей по общепринятым методикам с целью получения материала для цитологического исследования.

Весь полученный экссудат из плевральной полости собирали в полихлорвиниловый мешок для сбора жидкости одноразового набора Плеврофикс № 1. Предварительно в мешок добавляли 100 мл 5% раствора цитрата натрия для предотвращения коагуляции белка. Асцитическую жидкость собирали в три флакона емкостью 500 мл каждый, в которые предварительно добавляли 45–50 мл 5% раствора цитрата натрия. Первую порцию экссудата собирали в начале операции, вторую – в середине и третью – в конце. Полученный экссудат направляли в цитологическую лабораторию для исследования. При исследовании плевральной жидкости весь экссудат переливали в капельную воронку, при исследовании абдоминального выпота три порции экссудата вначале переливали в колбу, перемешивали, а затем около 500 мл экссудата переливали в капельную воронку, где клетки выпотной жидкости под действием силы тяжести оседали на дно капельной воронки (процесс седиментации). Отстаивание экссудата для концентрирования клеточных образцов проводили в капельной воронке в течение 60 минут (ФИГ. 2). По истечении времени экспозиции отстаивания экссудата обогащенный клеточными элементами придонный слой из капельной воронки сливали в 5–6 центрифужных пробирок. Затем центрифугировали экссудат на центрифуге «Элекон ЦЛМН-Р10-01» в течение 10 минут при скорости 2000 об/мин. Проводили оценку клеточности полученного препарата. Для этого каплю клеточного осадка переносили на предметное стекло, накрывали покровным стеклом и производили подсчет клеток в нативном препарате при увеличении 280х (объектив 40х, окуляр 7х) в 3–5 полях зрения.

Из полученного клеточного осадка делали 8–10 цитологических препаратов. Затем цитологические препараты сушили на воздухе. При окраске микропрепаратов по методу Паппенгейма их фиксировали раствором Май-Грюнвальда 15 минут и докрашивали в растворе азур-эозина по Романовскому-Гимзе 30 минут, а при окраске гематоксилин-эозином вначале препараты фиксировали этиловым спиртом 95⁰ 10 минут, затем окрашивали гематоксилином Майера 20 минут и эозином 30 секунд. Использование окраски гематоксилином и эозином делает препараты более прозрачными и лучше просматриваемыми.

Микроскопирование цитологических препаратов проводили под малым увеличением (объектив 10х) с использованием видеомикроскопа МС 1000 (LCD), Австрия, со встроенной электронной системой, жидкокристаллическим сенсорным дисплеем, что позволяет выполнить просмотр изображения в реальном времени. Обнаруженные атипические клетки исследовали при помощи иммерсионной системы (объектив 100х). Результаты микроскопирования фотографировали и сохраняли на CD Cart.

Заявленный способ лабораторной диагностики злокачественных новообразований при исследовании экссудатов является оптимальным и отвечает всем указанным требованиям.

Сущность изобретения поясняется графическими материалами, которые представлены на:

ФИГ. 1. Количество клеток в экссудате в зависимости от экспозиции времени отстаивания

ФИГ. 2. Концентрирование клеточного осадка в капельной воронке

ФИГ. 3. Цитологический препарат, приготовленный традиционным методом (микрофотография). Клетки измененного мезотелия. Окраска по Романовскому-Гимзе. Ув. объ. х40

ФИГ. 4. Цитологический препарат, приготовленный традиционным методом (микрофотография). Комплексы клеток аденокарциномы и единичные клетки, подозрительные на перстневиноклеточный рак. Окраска по Романовскому-Гимзе. Ув. объ. х100

ФИГ. 5. Цитологический препарат, приготовленный традиционным методом (микрофотография). Комплексы клеток аденокарциномы и единичные клетки, подозрительные на перстневидноклеточный рак. Окраска по Романовскому-Гимзе. Ув. объ. х20

ФИГ. 6. ИЦХ (микрофотография). Мембранная и цитоплазматическая экспрессия СА 125. Ув. объ. х20

ФИГ. 7. ИЦХ (микрофотография). Мембранная и цитоплазматическая экспрессия СК 7. Ув. объ. х100

ФИГ. 8. ИЦХ (микрофотография). Мембранная и цитоплазматическая экспрессия панцитокератина. Ув. объ. х10

Формула изобретения

Способ концентрирования клеточного материала в экссудатах для цитологического исследования злокачественных новообразований, характеризующийся тем, что получают экссудат путем лапароцентеза или пневмоцентеза, добавляют к нему раствор антикоагулянта цитрата натрия 5% в соотношении 10:1, центрифугируют его, переносят клеточный осадок на предметное стекло и проводят цитологическое исследование с учетом того, что при больших объемах экссудата (до 500–1500 мл) собирают три порции – в начале, в середине и в конце пункции, смешивают объемы всех трех порций и используют для исследования 500–600 мл, а при малых объемах экссудата (до 500 мл) собирают весь объем экссудата, далее переносят экссудат в капельную воронку и отстаивают в течение 60 минут до образования обогащенного придонного слоя, после чего переносят 20–50 мл придонного обогащенного слоя экссудата из капельной воронки в центрифужные пробирки и центрифугируют, сливают надосадочную жидкость и переносят концентрированный клеточный осадок на предметное стекло, при этом время центрифугирования для получения концентрированного клеточного осадка составляет не более 10 минут при скорости центрифугирования 2000 об/мин.

Изобретение "СПОСОБ КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ КЛЕТОЧНОГО МАТЕРИАЛА В ЭКССУДАТАХ ДЛЯ ЦИТОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ" (Леонов Михаил Генрихович, Новик Виктор Иванович, Беляева Софья Александровна, Ершова Янина Хаим-Беньяминовна) отмечено юбилейной наградой (25 лет Российской Академии Естествознания)
Медаль Альфреда Нобеля

Оформление наградных документов и заказ каталога