СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ УРОВНЯ ГЛИКИРОВАННОГО ГЕМОГЛОБИНА У БОЛЬНЫХ САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ 2 ТИПА

Название	СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ УРОВНЯ ГЛИКИРОВАННОГО ГЕМОГЛОБИНА У БОЛЬНЫХ САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ 2 ТИПА
Разработчик (Авторы)	Чурносов Михаил Иванович, Белоусова Оксана Николаевна, Сиротина Светлана Сергеевна, Чурносова Юлия Юрьевна, Полоников Алексей Валерьевич
Вид объекта патентного права	Изобретение
Регистрационный номер	2533456
Дата регистрации	19.09.2014
Правообладатель	Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Белгородский государственный национальный исследовательский университет"
Область применения (класс МПК)	G01N 33/68 (2006.01)

Описание изобретения

Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано для оценки степени компенсации сахарного диабета 2 типа.

Сахарный диабет - это эндокринное заболевание, характеризующееся хроническим повышением уровня сахара в крови вследствие абсолютного или относительного дефицита инсулина - гормона поджелудочной железы. Заболевание приводит к нарушению всех видов обмена веществ, поражению сосудов, нервной системы, а также других органов и систем. Согласно литературным данным роль генетических факторов в развитии СД2 составляет 60-80% [Аметов А.С. Гипергликемия и глюкозотоксичность - ключевые факторы прогрессирования сахарного диабета 2-го типа [Текст] / А.С. Аметов, Л.Н. Богданова // Русский медицинский журнал. - 2010. - Т.18, №23. - С.1416-1418; Bluher, M Role of muscle and fat tissue in the pathogenesis of type 2 diabetes [Text] / M. Bluher, M. Stumvoll // Dtsch. Med. Wochenschr. - 2006. - Vol.131, suppl.8. - P.S231-S235].

Важное значение в определении степени компенсации сахарного диабета 2 типа имеет уровень гликированного гемоглобина, который отражает средний уровень гликемии за последние три месяца [Дедов И.И. Алгоритмы специализированной медицинской помощи больным сахарным диабетом [Текст] / И.И. Дедов, M.В. Шестакова // Сахарный диабет. - 2011. - 72 с. - (Прил. к журн. №3, вып.5)]. Высокий уровень гликированного гемоглобина говорит о декомпенсированном сахарном диабете и возможно более раннем развитии осложнений на фоне повышенной гликемии. Низкий уровень гликированного гемоглобина отражает благоприятное течение сахарного диабета и положительный эффект от проводимого лечения сахароснижающими препаратами.

По данным литературы установлено, что фактор некроза опухолей и его рецепторы ассоциированы с клинико-лабораторным статусом больных сахарным диабетом 2-го типа [Кондратова Н.В. Клинико-лабораторные проявления метаболического синдрома у пациентов с различными аллелями гена фактора некроза опухолей альфа [Текст]: дис. канд. мед. наук: 14.00.06 / Н.В. Кондратова. - M., 2004. - 121 с.: ил.].

Рецептор фактора некроза опухолей 1-го типа (TNFR1), который известен также как CD120a, является белком с молекулярной массой 55-60 kDa (p55) и опосредует все виды действия факторов некроза опухолей - апоптоз, пролиферацию и дифференцировку клеток, а также обладает противовирусной активностью. Ген TNFR1 у человека расположен на хромосоме 12р13. Данный рецептор несет ответственность за острый воспалительный ответ и экспрессируется в большинстве типов клеток. Клеточный ответ приводит к протеолитическому расщеплению мембранного рецептора и образованию его растворимой формы. Растворимый TNFR1 стабилизирует циркулирующий TNF и увеличивает период полураспада данного цитокина. Факторы некроза опухолей, соединяясь со своим рецептором, образуют домен, обусловливающий конформационные изменения TNFR1 и инициацию определенного клеточного сигнала [Insulin sensitivity and adipocytokines in patients with diabetes and prediabetes [Text] / A. Mayorov, K. Urbanova, G. Galstyan [et al.] // Journal of Diabetes, 2009. - Vol.1, suppl. s.1. - P. A17].

В изученной научно-медицинской и доступной патентной литературе авторами не было обнаружено способа прогнозирования уровня гликированного гемоглобина у больных сахарным диабетом 2-го типа на основе данных о полиморфизме гена рецептора фактора некроза опухоли 1-го типа.

Для оценки сложившейся патентной ситуации был выполнен поиск по охранным документам за период с 1990 по 2013 гг. Анализ документов производился по направлению: способ прогнозирования уровня гликированного гемоглобина у больных сахарным диабетом 2-го типа на основе молекулярно-генетических данных в зависимости от полиморфных маркеров генов рецептора 1-го типа фактора некроза опухоли.

Известен способ по патенту №2038597 (публ. 27.06.1995) «Способ определения гликированного гемоглобина в крови», включающий забор крови, отделение эритроцитов, их гемолиз, нанесение гемолизата на колонку с сорбентом с привитыми группами м-аминофенилборной кислоты, элюирование гликированного гемоглобина с последующим измерением оптической плотности и расчетом, отличающийся тем, что в качестве сорбента используют кремнезем, содержащий привитые группы м-аминофенилборной кислоты.

Недостатком этого метода является определение только гликированного гемоглобина, без оценки уровня компенсации сахарного диабета 2 типа.

За прототип выбран патент №2022270 (публ. 30.10.1994 г.) «Способ определения компенсации сахарного диабета у детей». Данное изобретение относится к медицине, в частности к эндокринологии, может быть использовано для установления компенсации сахарного диабета у детей, а также для оценки правильности выбора дозы инсулина. Сущность изобретения: для определения компенсации сахарного диабета у детей определяют содержание гликированных гемоглобинов и активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в крови. И при содержании гликированных гемоглобинов до 3,5% и активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в пределах 1,8-2,7 мкмоль мин/г Hb определяют компенсацию сахарного диабета.

Недостаток прототипа заключается в том, что он имеет ограниченное применение, только для детей, и не учитывает влияние генетических маркеров на уровень гликированного гемоглобина больных сахарным диабетом 2 типа.

Задачей настоящего исследования является расширение арсенала способов прогнозирования уровня гликированного гемоглобина для определения компенсации сахарного диабета 2 типа.

Технический результат использования изобретения - возможность определения компенсации сахарного диабета 2 типа путем прогнозирования уровня гликированного гемоглобина у индивидуумов русской национальности, больных сахарным диабетом 2 типа по данным генетического полиморфизма рецептора фактора некроза опухоли 1-го типа (+36A/G TNFR1).

В соответствии с поставленной задачей был разработан способ прогнозирования уровня гликированного гемоглобина у больных сахарным диабетом 2-го типа, включающий:

- забор периферической венозной крови;

- выделение ДНК из периферической венозной крови;

- анализ полиморфизма гена +36A/G TNFR1;

- прогнозирование повышенного уровня гликированного гемоглобина у больных сахарным диабетом 2-го типа в случае выявления полиморфного варианта +36АА TNFR1.

Новизна и изобретательский уровень заключается в том, что из уровня техники не известна возможность прогноза уровня гликированного гемоглобина у больных сахарным диабетом 2-го типа по наличию генотипа +36АА TNFR1 гена рецептора фактора некроза опухоли 1-го типа (+36A/G TNFR1).

Способ осуществляют следующим образом.

ДНК выделяют из образцов периферической венозной крови больных сахарным диабетом 2-го типа в 2 этапа. На первом этапе к 4 мл крови добавляют 25 мл лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5 мМ MgCl₂, 10 мМ трис-HCl (pH=7,6). Полученную смесь перемешивают и центрифугируют при 4°C, 4000 об./мин в течение 20 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (pH=8,0) и 75 мМ NaCI, ресуспензируют. Затем прибавляют 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы К (10 мг/мл) и инкубируют образец при 37°C в течение 16 часов.

На втором этапе из полученного лизата последовательно проводят экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об./мин в течение 10 минут. После каждого центрифугирования производят отбор водной фазы. ДНК осаждают из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. Сформированную ДНК растворяют в бидистиллированной, деионизованной воде и хранят при -20°C.

Выделенную ДНК затем подвергают полимеразной цепной реакции с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров (таблица 1).

Анализ полиморфизма гена TNFR1 в области 1 экзона проводили методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК на амплификаторе IQ5 (Bio-Rad) с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров с последующим анализом полиморфизма методом дискриминации аллелей. Реакционная смесь объемом 25 мкл включает: 67 мМ трис-HCl (pH=8,8), 2,5 мМ MgCl₂, 0,1 мкг геномной ДНК, по 10 пМ каждого праймера, по 5 пкмоль каждого зонда, по 200 мкМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP и 1 единицу активной Taq-полимеразы. После денатурации (5 мин при 95°C) выполняли 40 циклов амплификации по схеме: отжиг праймеров - 1 мин при 50°C; денатурация - 15 сек при 95°C.

Изобретение характеризуется на фигурах 1 и 2.

На фигуре 1 представлена дискриминация аллелей по локусу +36A/G TNFR1 (где ● - гомозиготы 36АА TNFR1, □ - гомозиготы 36GG TNFR1, ▲ - гетерозиготы 36AG TNFR1, ◊ - отрицательный контроль), которая осуществляется методом Tag Man зондов по данным величин RFU, где RFU - это уровень относительной флуоресценции (УОФ) каждого зонда. Зонд с флуоресцентным красителем ROX соответствует аллелю A, зонд с красителем - FAM-аллелю G.

Две полосы, вертикальная и горизонтальная, делят график на четыре секции: одна для каждого гомозиготного состояния, одна для гетерозиготного состояния и секция без реакции. Присвоение генотипов неизвестным образцам определяется вычерчиванием RFU для одного флуорофора (на оси x) относительно RFU для другого флуорофора (на оси у) на диаграмме дискриминации аллелей.

- Если значения RFU неизвестного образца находятся выше горизонтальной полосы и правее вертикальной полосы, генотип гетерозиготен (GA).

- Если значения RFU неизвестного образца находятся выше горизонтальной полосы и левее вертикальной полосы, генотип гомозиготен по аллелю G (RFU аллеля G отложены по оси y).

- Если значения RFU неизвестного образца находятся ниже горизонтальной полосы и правее вертикальной, генотип гомозиготен по аллелю A (RFU аллеля А отложены по оси x).

- Если значения RFU неизвестного образца находятся ниже горизонтальной полосы и левее вертикальной, определение генотипа невозможно (в данном случае неопределенный образец - отрицательный контроль).

На фигуре 2 представлены ассоциации генетического полиморфизма +36A/G TNFR1 с уровнем гликированного гемоглобина у больных СД2.

Формирование базы данных и статистические расчеты осуществлялись с использованием программы «STATISTICA 6.0». Ассоциации аллелей и генотипов изученных ДНК-маркеров с течением заболевания у пациентов с сахарным диабетом 2-го типа оценивали с помощью анализа таблиц сопряженности 2×2 с расчетом критерия χ² с поправкой Йетса на непрерывность и отношения шансов (OR) с 95% доверительными интервалами (CI) [Реброва О. Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA [Текст] / О.Ю. Реброва. - М.: Медиасфера, 2006. - 305 с.; Боровиков В. Statistica: искусство анализа данных на компьютере / В. Боровиков. - 2-е изд. - СПб.: Питер, 2003. - 688 с.: ил. - (Для профессионалов)].

Возможность использования предложенного способа для оценки уровня гликированного гемоглобина у больных сахарным диабетом 2-го типа подтверждает анализ результатов наблюдений 236 больных сахарным диабетом. Пациенты включались в соответствующую группу больных только после установления диагноза заболевания, подтвержденного с помощью клинических и лабораторно-инструментальных методов обследования, являлись индивидуумами русской национальности, уроженцами Центрального Черноземья России и не имели родства между собой.

Установлено, что медиана уровня гликированного гемоглобина в исследуемой группе больных составила 8,65% (интерквартильный размах 7,20-9,90%). Выявлено, что больные СД2 с генотипом +36АА TNFR1 отличаются повышенным уровнем гликированного гемоглобина (медиана - 8,95%, нижний квартиль - 7,80%, верхний квартиль - 10,60%) по сравнению с больными, имеющими генетические варианты +36AG и +36GG TNFR1 (медиана - 8,50%, интерквартильный размах 7,10-9,6%, p=0,03) (фиг.2).

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что маркером повышенного уровня гликированного гемоглобина у индивидуумов русской национальности, больных сахарным диабетом 2 типа, является полиморфный вариант +36AA TNFR1, что может быть использовано в эндокринологических стационарах при обследовании пациентов с сахарным диабетом 2 типа для формирования группы риска с неблагоприятным клиническим течением СД2 (с прогнозируемым повышенным уровнем гликированного гемоглобина), что позволит оптимизировать тактику ведения данных пациентов (раннее назначение инсулинотерапии, реализация мероприятий по профилактике осложнений сахарного диабета 2 типа, проведение курсов сосудистой и метаболической терапии, более частое посещение эндокринолога и смежных специалистов).

Формула изобретения

Способ прогнозирования уровня гликированного гемоглобина y индивидуумов русской национальности, больных сахарным диабетом 2 типа, включающий забор периферической венозной крови, отличающийся тем, что после выделения из периферической венозной крови ДНК, проводят анализ полиморфизма гена рецептора фактора некроза опухоли 1-го типа (+36A/G TNFR1) и прогнозируют повышенный уровень гликированного гемоглобина у больных сахарным диабетом 2-го типа в случае выявления полиморфного варианта +36АА TNFR1.

Изобретение "СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ УРОВНЯ ГЛИКИРОВАННОГО ГЕМОГЛОБИНА У БОЛЬНЫХ САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ 2 ТИПА" (Чурносов Михаил Иванович, Белоусова Оксана Николаевна, Сиротина Светлана Сергеевна, Чурносова Юлия Юрьевна, Полоников Алексей Валерьевич) отмечено юбилейной наградой (25 лет Российской Академии Естествознания)
Медаль Альфреда Нобеля

Оформление наградных документов и заказ каталога