СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ТЕЧЕНИЯ И ЭФФЕКТИВНОСТИ ТЕРАПИИ САХАРНОГО ДИАБЕТА 2 ТИПА

Название	СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ТЕЧЕНИЯ И ЭФФЕКТИВНОСТИ ТЕРАПИИ САХАРНОГО ДИАБЕТА 2 ТИПА
Разработчик (Авторы)	Чурносов Михаил Иванович, Белоусова Оксана Николаевна, Сиротина Светлана Сергеевна, Чурносова Юлия Юрьевна, Полоников Алексей Валерьевич
Вид объекта патентного права	Изобретение
Регистрационный номер	2533286
Дата регистрации	17.09.2014
Правообладатель	Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Белгородский государственный национальный исследовательский университет"
Область применения (класс МПК)	G01N 33/68 (2006.01)

Описание изобретения

Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано для прогнозирования течения и эффективности проводимой терапии у больных сахарным диабетом 2 типа.

Сахарный диабет 2 типа (СД2) - самое распространенное эндокринное заболевание, которое представляет собой одну из острейших медико-социальных проблем, так как ведет к ранней инвалидизации и повышению смертности среди населения вследствие развития различных осложнений. Сахарный диабет 2-го типа (инсулин-независимый диабет) - метаболическое заболевание, характеризующееся хронической гипергликемией, развивающейся в результате нарушения секреции инсулина или механизмов его взаимодействия с клетками тканей [Дедов И.И., Мельниченко Г.А., Фадеев В.В. Эндокринология: учебник для мед. вузов/ Под ред. акад. РАМН И.И. Дедова. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2008. - 430 с.; Joseph NA., Greenberg AS. Adipocytocines and insulin resistance. // J Clin Endocrinol. Metab. 2004. - №89(2). - P.447-460].

Очень важное значение для качества жизни пациентов имеет течение заболевания и эффективность от проводимой терапии.

Как свидетельствуют результаты ряда исследований, значимую роль в патогенезе сахарного диабета 2-го типа и его осложнений играют провоспалительные цитокины, такие как ФНО и его рецепторы [Рыдловская А.В., Симбирцев А.С. «Функциональный полиморфизм гена TNFα и патология». Цитокины и воспаление. 2005. Т. 4, №3. С.4-10].

Ген Ltα, который в литературе упоминается как лимфотоксин α или TNFβ, представляет собой гликопротеид массой около 33 кДа, который продуцируется стимулированными митогенами T-лимфоцитами и лейкоцитами, а также секретируется фибробластами, астроцитами, миеломными клетками, эпителио- и эндотелиоцитами. Ген Ltα находится на шестой хромосоме (6р21.3), содержит 4 экзона и расположен на близком расстоянии от гена TNFα. Ltα не имеет трансмембранного домена, но может удерживаться на мембране за счет образования комплекса с трансмембранным белком рЗЗ (лимфотоксин бета) [S.P. Weisberg, D. McCann, М. Desai [et al.]. Obesity is associated with macrophage accumulation in adipose tissue [Text] // J. Clin. Invest. - 2003. - Vol.112, №12. - P.1796-1808].

Ген Ltα обладает рядом подобных TNFα биологических активностей, включая способность вызывать геморрагический некроз опухолей. Лимфотоксины занимают особое место в семействе фактора некроза опухолей. Подобно растворимой форме TNF, не имеющий трансмембранного домена, Ltα играет важную роль в клеточном иммунном ответе, воспалительных реакциях [Suriano, А.N. Sanford, N. Kim [et al.] // Mol. Cell. Biol. - 2005. - Vol.25, №20. - P.9073-9081], а также, возможно, в синдроме септического шока. Было обнаружено, что Ltα способен привлекать нейтрофилы в очаг респираторного воспаления, индуцировать фагоцитоз и обладает способностью индуцировать защиту от микроорганизмов, таких как Plasmodium falciparum, Haemophilus influenzae, Mycobacterium tuberculosis. Генетические полиморфизмы Ltα у человека ассоциированы с некоторыми инфекционными заболеваниями, ревматической, аллергической и эндокринной патологией, хроническим лимфолейкозом, генитальным эндометриозом, хроническим калькулезным холециститом, миомой матки, хроническим гломерулонефритом [V. Boraska, N.W Rayner, С.J. Groves [et al.]. Large-scale association analysis of TNF/LTA gene region polymorphisms in type 2 diabetes [Text] // BMC Medical Genetics. - 2010. - Vol.11, №1. - P. 69-70].

В настоящее время показано, что провоспалительную роль Ltα можно объяснить тем, что он вызывает активацию некоторых хемокинов (RANTES, IP-10, МСР-1, BLC, SLC, ELC) и молекул клеточной адгезии (VCAM, ICAM, E-selectin, MAdCAM-1) в эндотелиальных клетках. Ltα связывается с теми же рецепторами, что и TNFα, однако способность активировать рецепторы у Ltα менее выражена, зачастую он проявляет лишь частичную агонистическую активность. Ltα является хемоаттрактантом для нейтрофилов, стимулирует в них образование пероксид-ионов, усиливает фагоцитоз и адгезию к эндотелию, стимулирует активность фибробластов, играет роль в процессе заживления ран, а также провоцирует выработку стресс-гормонов, влияет на метаболизм глюкозы, влияет на липидный метаболизм, коагуляцию (Кетлинский, С.А. Цитокины [Текст]: [моногр.] / С.А. Кетлинский, А.С. Симбирцев. - СПб.: Фолиант, 2008. - 549 с.: ил., табл.

Известен способ прогнозирования микрососудистых осложнений - диабетической нефропатии - путем определения прогностических факторов риска, отличающийся тем, что исследуют исходные значения соотношения систолодиастолических скоростей (Vmax/Vmin) в дуговых почечных артериях, гликозилированного гемоглобина (HbAlC) в %, диастолического артериального давления (АДд) в мм рт.ст., триглицеридов (ТГ) сыворотки крови в ммоль/л, решают дискриминантное уравнение:

Д=-207,116·Vmax/Vmin-28,659·HbA1C-3,068·АДд-20,079·ТГ,

и при величине Д меньше 844,07 прогнозируют развитие диабетической нефропатии в течение года (пат. РФ №2200328, МКИ 7 G01N 33/72, 33/92).

Известен способ прогнозирования течения сахарного диабета 1 типа (пат. РФ №2320272, кл. A61B 10/00), заключающийся в том, что устанавливают прогностические факторы риска: возраст, уровень антиокислительной активности, содержание общих липидов, концентрацию диеновых конъюгатов, далее прогностические значения факторов определяют по формулам и прогнозируют развитие микрососудистых осложнений, соответствующих длительности заболевания.

К недостаткам указанных способов следует отнести невысокую точность прогноза и ограниченную возможность использования для прогноза только у пациентов с СД 1 типа, в то время как возможность прогнозирования течения СД 2 типа и эффективность от проводимой терапии не оценивается.

Известен патент РФ №2461356, опубл. 20.09.2012, «Способ прогнозирования течения сахарного диабета», в котором в качестве факторов риска используют различные признаки, например умение свернуть язык в трубочку, миопия, и др., и при наличии у пациента с сахарным диабетом 1 типа 5-ти и более признаков прогнозируют высокий риск развития диабетической нефропатии и артериальной гипертонии, при наличии у пациента с сахарным диабетом 2 типа 5-ти и более признаков прогнозируют высокий риск развития ишемической болезни сердца, а при наличии 4-х и менее признаков у пациентов с сахарным диабетом 1 и 2 типов прогнозируют минимальный риск неблагоприятного течения сахарного диабета. Недостаток заключается в том, что он рассматривает лишь наличие пороков развития у пациентов с сахарным диабетом 1-го и 2-го типов и наличие определенных навыков, но не учитывает влияние генетических маркеров на эффективность проводимой терапии больных сахарным диабетом 2 типа.

В качестве прототипа предлагаемого изобретения выбран способ прогнозирования тяжести ИЗСД у детей в зависимости от спектра антигенов системы HLA, определяемого в дебюте заболевания (I. Rjasanowski et al., Exp. Clin. Endocrinol. Vol.89, N 2, 1987. PP.216-224), заключающийся в заборе крови у детей, заболевших ИЗСД, анализе крови для определения состава антигенов системы HLA, прогнозе более тяжелого течения СД при определении генотипа HLA-B 8, DR 3. Недостатком прототипа является ограниченность его применения, т.к. он предназначен только для прогнозирования тяжести СД у детей с инсулинозависимостью и не может быть использован для прогнозирования течения и эффективности проводимой терапии у больных сахарным диабетом 2 типа.

Задачей настоящего исследования является создание способа прогнозирования течения и эффективности проводимой терапии у больных сахарным диабетом 2 типа по данным генетического полиморфизма лимфотоксина α (+250A/G Ltα).

Технический результат использования изобретения - получение критериев оценки течения заболевания и эффективности проводимой терапии у индивидуумов русской национальности, страдающих сахарным диабетом 2-го типа.

В соответствии с поставленной задачей был разработан способ прогнозирования течения и эффективности терапии сахарного диабета 2-го типа у индивидуумов русской национальности, включающий: забор и анализ крови, выделение ДНК из периферической венозной крови; анализ полиморфизма гена лимфотоксина альфа (+250A/G Ltα); прогноз благоприятного течения заболевания и положительного эффекта от проводимой терапии таблетированными сахароснижающими препаратами у больных сахарным диабетом 2-го типа в случае выявления полиморфного варианта +250GG Ltα.

Новизна и изобретательский уровень заключаются в том, что из уровня техники не известна возможность прогноза течения и эффективности терапии сахарного диабета 2-го типа по наличию генотипа +250GG Ltα гена лимфотоксина альфа (+250A/G Ltα) у индивидуумов русской национальности.

Способ осуществляют следующим образом

ДНК выделяют из образцов периферической венозной крови больных сахарным диабетом 2-го типа в 2 этапа. На первом этапе к 4 мл крови добавляют 25 мл лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% тритон X-100, 5 мМ MgCl₂, 10 мМ трис-HCl (pH 7,6). Полученную смесь перемешивают и центрифугируют при 4°C, 4000 об./мин в течение 20 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (рН 8,0) и 75 мМ NaCl, ресуспензируют. Затем прибавляют 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы K (10 мг/мл) и инкубируют образец при 37°C в течение 16 часов.

На втором этапе из полученного лизата последовательно проводят экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об./мин в течение 10 минут. После каждого центрифугирования производят отбор водной фазы. ДНК осаждают из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. Сформированную ДНК растворяют в бидистиллированной, деионизованной воде и хранят при -20°C.

Выделенную ДНК затем подвергают полимеразной цепной реакции с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров (таблица 1).

Анализ полиморфизма гена Ltα в 1 интроне проводили методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК на амплификаторе IQ5 (Bio-Rad) с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров с последующим анализом полиморфизма методом дискриминации аллелей. Реакционная смесь объемом 25 мкл включает: 67 мМ трис-HCl (pH 8,8), 2,5 мМ MgCl₂, 0,1 мкг геномной ДНК, по 10 пМ каждого праймера, по 5 пкмоль каждого зонда, по 200 мкМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP и 1 единицу активной Taq-полимеразы. После денатурации (5 мин при 95°C) выполняли 40 циклов амплификации по схеме: отжиг праймеров - 1 мин при 50°C; денатурация - 15 сек при 95°C.

Изобретение характеризуется следующими графическими материалами.

На фиг.1 представлена дискриминация аллелей по локусу +250A/G Ltα (где ● - гомозиготы +250GG,  - гомозиготы +250АА, ^▲ - гетерозиготы +250AG,  - отрицательный контроль), которая осуществляется методом Tag Man зондов по данным величин RFU, где RFU - это уровень относительной флуоресценции (УОФ) каждого зонда. Зонд с флуоресцентным красителем ROX соответствует аллелю A, зонд с красителем FAM - аллелю G.

Две полосы, вертикальная и горизонтальная, делят график на четыре секции: одна для каждого гомозиготного состояния, одна для гетерозиготного состояния и секция без реакции. Присвоение генотипов неизвестным образцам определяется вычерчиванием RFU для одного флуорофора (на оси x) относительно RFU для другого флуорофора (на оси у) на диаграмме дискриминации аллелей.

- Если значения RFU неизвестного образца находятся выше горизонтальной полосы и правее вертикальной полосы, генотип гетерозиготен (GA).

- Если значения RFU неизвестного образца находятся выше горизонтальной полосы и левее вертикальной полосы, генотип гомозиготен по аллелю G (RFU аллеля G отложены по оси у).

- Если значения RFU неизвестного образца находятся ниже горизонтальной полосы и правее вертикальной, генотип гомозиготен по аллелю A (RFU аллеля А отложены по оси x).

- Если значения RFU неизвестного образца находятся ниже горизонтальной полосы и левее вертикальной, определение генотипа невозможно (в данном случае неопределенный образец - отрицательный контроль).

На фиг.2 иллюстрируется уровень гликемии у больных СД2 в зависимости от генотипов локуса +250A/G Ltα.

На фиг.3 иллюстрируется уровень гликированного гемоглобина у больных СД2 в зависимости от генотипов локуса +250A/G Ltα.

На Фиг.4. представлена частота генотипа +250GG Ltα среди больных СД2, получающих пероральные сахароснижающие препараты в зависимости от эффективности лечения.

Формирование базы данных и статистические расчеты осуществлялись с использованием программы «STATISTICA 6.0». Ассоциации аллелей и генотипов изученных ДНК-маркеров с течением заболевания у пациентов с сахарным диабетом 2-го типа оценивали с помощью анализа таблиц сопряженности 2×2 с расчетом критерия χ² с поправкой Йетса на непрерывность и отношения шансов (OR) с 95% доверительными интервалами (CI) [Реброва, О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA [Текст] / О.Ю. Реброва. - М.: Медиасфера, 2006. - 305 с.; Боровиков, В. Statistical: искусство анализа данных на компьютере / В. Боровиков. - 2-е изд. - СПб.: Питер, 2003. - 688 с.: ил. - (Для профессионалов)].

Возможность использования предложенного способа для оценки течения и эффективности терапии сахарного диабета 2-го типа подтверждает анализ результатов наблюдений 236 больных сахарным диабетом и 308 человек популяционного контроля. В исследуемую группу включались индивидуумы русской национальности, являющиеся уроженцами Центрального Черноземья России и не имеющие родства между собой, не страдающие заболеваниями эндокринной системы. Пациенты включались в соответствующую группу больных только после установления диагноза заболевания, подтвержденного с помощью клинических и лабораторно-инструментальных методов обследования. В группу популяционного контроля включались индивидуумы без заболеваний эндокринной системы. В рассматриваемой выборке у 209 пациентов (88,56%) сахарный диабет был декомпенсирован, и лишь у 27 больных (11,44%) наблюдалась компенсация СД2 на момент исследования.

В исследуемой группе из 236 человек ангиопатия нижних конечностей встречалась у 130 пациентов (55,08%), полинейропатия нижних конечностей - у 230 пациентов (97,45%), синдром диабетической стопы - у 49 пациентов (20,76%), диабетическая нефропатия - у 144 пациентов (61,01%), ретинопатия - у 171 пациента (72,45%).

Было изучено наличие инсулинопотребности у больных сахарным диабетом 2 типа. На момент исследования установлена инсулинопотребность у 169 пациентов (71,61%), отсутствие инсулинопотребности установлено у 67 пациентов (28,39%).

Для проведения анализа эффективности терапии СД2 пациентов по виду предварительно полученного лечения распределили следующим образом: таблетированная терапия - 72 пациента (30,52%), инсулинотерапия - у 64 пациентов (27,11%), комбинированная терапия - у 100 пациентов (42,37%). Положительный эффект от проводимой терапии был выявлен у 71 пациента (30,08%), отсутствие эффекта наблюдалось у 165 пациентов (69,92%).

Установлено, что у больных СД2 без ангиопатии нижних конечностей концентрация генотипа +250GG лимфотоксина α составляет 16,04% и в 3 раза превышает аналогичный показатель как контрольной группы (4,57%, χ²=13,34, р=0,0009, с учетом поправки Бонферрони, минимизирующей вероятность ложноположительных результатов (ошибки 1-го рода), p_cor=0,0027, OR=3,99, 95% CI 1,79-8,79), так и пациентов с ангиопатией нижних конечностей (5,38%, χ²=6,14, p=0,01, p_cor=0,03, OR=3,36, 95% CI 1,25-9,36). Получено, что у больных СД2 без нефропатии концентрация генотипа +250GG лимфотоксина α составляет 17,39% и в 3 раза превышает аналогичный показатель как контрольной группы (4,57%, х2=14,96, р=0,0007, p_cor=0,0021, OR=4,41, 95% CI 1,93-10,05) так и пациентов с нефропатией (5,56%, χ²=7,36, p=0,01, p_cor=0,03). Установлено, что у больных СД2 без ретинопатии концентрация генотипа +250GG лимфотоксина α составляет 15,38% и в 4 раза превышает аналогичный показатель контрольной группы (4,57%, χ²=8,69, p=0,01, p_cor=0,03, OR=3,80, 95% CI 1,48-9,69). Среди пациентов с ретинопатией частота этого маркера составила 8,29% (χ²=2,01, р=0,16). Полученные результаты свидетельствуют о том, что у больных СД2 без синдрома диабетической стопы концентрация генотипа +250GG лимфотоксина α составляет 12,90% и существенно превышает аналогичные показатели как контрольной группы (4,57%, χ²=10,19, p=0,01, p_cor=0,03, OR=3,10, 95% CI 1,49-6,51), так и пациентов с синдромом диабетической стопы (0%, χ²=5,71, p=0,017, p_cor=0,051).

Как видно на фигурах 2 и 3, генетический вариант +250GG Ltα маркирует низкий уровень гликемии и гликированного гемоглобина (медиана - 8,50 ммоль/л, интерквартильный размах - 6,05-11,25 ммоль/л, p=0,01 и медиана - 6,91%, интерквартильный размах - 6,16-8,70%, р=0,001, соответственно) по сравнению с пациентами с генетическими вариантами +250AG и +250АА Ltα (медиана - 10,50 ммоль/л, нижний квартиль - 8,20 ммоль/л, верхний квартиль - 12,60 ммоль/л и медиана - 8,80%, нижний квартиль - 7,40%, верхний квартиль - 10,30%, соответственно).

Анализ концентраций генетических полиморфизмов факторов некроза опухолей и их рецепторов в группах больных СД2 в зависимости от эффективности терапии и в контрольной группе выявил различия в частотах генетических вариантов по локусу +250A/G Ltα: у больных СД2 с положительным эффектом от проводимой терапии распространенность генотипа +250GG лимфотоксина α составляет 18,31% и в 3-4 раза превышает аналогичный показатель как контрольной группы (4,57%, χ²=14,42, p=0,0008, с учетом поправки Бонферрони, минимизирующей вероятность ложноположительных результатов, p_cor=0,0024, OR=4,69, 95% CI 1,95-11,26), так и пациентов без эффекта от терапии (6,67%, χ²=6,15, p=0,01,p_cor=0,03).

Детальный анализ связей генетических полиморфизмов цитокинов с эффективностью лечения в группах пациентов с СД2, получавших различную терапию (пероральные сахароснижающие препараты, инсулинотерапию и комбинированную терапию - в виде таблетированных сахароснижающих препаратов и инсулина), выявил значимые ассоциации генетических вариантов по локусу +250A/G Ltα с эффективностью терапии у больных, получавших пероральные сахароснижающие препараты. Как представлено на фиг.4, в группе пациентов с положительным эффектом от терапии сахароснижающими препаратами (n=48) частота генотипа +250GG Ltα составила 20,84%, тогда как среди больных с отрицательным эффектом от этой терапии (n=24) данный показатель равнялся - 0,00% (χ²=4,20, p=0,04,), а в контрольной группе он был равен 4,57% (χ²=14,95, р=0,0007, p_cor=0,0021, OR=5,51, 95% CI 2,10-14,37).

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что маркером благоприятного течения заболевания и положительного эффекта от проводимой терапии, в том числе пероральными сахароснижающими препаратами, у индивидуумов русской национальности, больных сахарным диабетом 2 типа, является полиморфный вариант +250GG Ltα, что может быть использовано в эндокринологических стационарах при обследовании пациентов с сахарным диабетом 2 типа для формирования групп с пониженным риском тяжелого течения заболевания и развития осложнений, с положительным эффектом от проводимой терапии сахароснижающими препаратами, с целью оптимизации дальнейшей тактики ведения данных пациентов (осмотр офтальмолога 1 раз в год, невролога 1 раз в год, анализ мочи на микроальбуминурию 2 раза в год, гликированный гемоглобин 1 раз в 3 месяца, самостоятельный осмотр ног, курс сосудистой и метаболической терапии 1 раз в год, что в два раза реже по сравнению с пациентами из повышенной группы риска) и назначения этим пациентам лечения пероральными сахароснижающими препаратами.

Формула изобретения

Способ прогнозирования течения и эффективности терапии сахарного диабета 2-го типа у индивидуумов русской национальности, включающий забор и анализ крови, отличающийся тем, что после выделения ДНК из периферической венозной крови проводят анализ полиморфизма гена лимфотоксина α (+250A/G Ltα) и в случае выявления полиморфного варианта +250GG Ltα прогнозируют благоприятное течение сахарного диабета 2-го типа и получение положительного эффекта от проведения терапии пероральными сахароснижающими препаратами.

Изобретение "СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ТЕЧЕНИЯ И ЭФФЕКТИВНОСТИ ТЕРАПИИ САХАРНОГО ДИАБЕТА 2 ТИПА" (Чурносов Михаил Иванович, Белоусова Оксана Николаевна, Сиротина Светлана Сергеевна, Чурносова Юлия Юрьевна, Полоников Алексей Валерьевич) отмечено юбилейной наградой (25 лет Российской Академии Естествознания)
Медаль Альфреда Нобеля

Оформление наградных документов и заказ каталога