СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА РАЗВИТИЯ ДИАБЕТИЧЕСКОЙ АНГИОПАТИИ НИЖНИХ КОНЕЧНОСТЕЙ У БОЛЬНЫХ САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ 2 ТИПА

Название	СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА РАЗВИТИЯ ДИАБЕТИЧЕСКОЙ АНГИОПАТИИ НИЖНИХ КОНЕЧНОСТЕЙ У БОЛЬНЫХ САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ 2 ТИПА
Разработчик (Авторы)	Чурносов Михаил Иванович, Белоусова Оксана Николаевна, Сиротина Светлана Сергеевна, Чурносова Юлия Юрьевна
Вид объекта патентного права	Изобретение
Регистрационный номер	2507520
Дата регистрации	20.02.2014
Правообладатель	Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Белгородский государственный национальный исследовательский университет"
Область применения (класс МПК)	G01N 33/50 (2006.01)

Описание изобретения

Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано для прогнозирования риска развития ангиопатии нижних конечностей больных сахарным диабетом 2 типа.

Сахарный диабет 2-го типа (СД2) представляет собой эндокринное заболевание, которое возникает в результате поражения b-клеток поджелудочной железы или развития инсулинорезистентности [Joseph NA., Greenberg AS. Adipocytocines and insulin resistance. // J Clin Endocrinol. Metab. 2004. - №89(2). - P. 447-460]. Болезнь проявляется гипергликемией, поражением органов-мишеней [Дедов И.И., Мельниченко Г.А., Фадеев В.В. Эндокринология: учебник для мед.вузов/ Под ред. акад. РАМН И.И.Дедова. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2008. - 430 с.].

Течение сахарного диабета 2-го типа характеризуется развитием различных осложнений. Наиболее частыми его осложнениями являются диабетическая ретинопатия, ангиопатия нижних конечностей, диабетическая нефропатия, полинейропатия нижних конечностей. Связь между продолжительностью жизни пациентов и осложнениями сахарного диабета очевидна. Одним из грозных осложнений сахарного диабета 2-го типа является ангиопатия нижних конечностей, которая проявляется болями в ногах, развитием «перемежающейся хромоты», снижением пульсации артерий стоп и развитием сидрома диабетической стопы. В дальнейшем при отсутствии лечения развивается гангрена с последующей ампутацией конечности [Williams D.T., Price Р, Harding K.G. "An Evaluation of Screening Methods for Arterial Component of Diabetic Foot Disease in the Community". Program and abstractbook of the 4 th international Symposium on the Diabetic foot, 22-24 May 2003, Noordwijekerhout, The Netherlands: 62].

Как свидетельствуют результаты ряда исследований, значимую роль в развитии осложнений сахарного диабета 2-го типа играют провоспалительные цитокины, такие как ФНО и его рецепторы [Рыдловская А.В., Симбирцев А.С. «Функциональный полиморфизм гена TNFα и патология». Цитокины и воспаление. 2005. Т. 4, №3. С.4-10]. Фактор некроза опухоли - внеклеточный белок, многофункциональный провоспалительный цитокин, продуцируемый в основном моноцитами и макрофагами, влияет на липидный метаболизм, коагуляцию, устойчивость к инсулину и функционирование эндотелия. Этот цитокин действует на клетки-мишени практически всех органов и тканей. Ген человеческого ФНОα (TNFα) был клонирован в 1985 году. Ген картирован на хромосоме 6р21.3, в локусе, кодирующем молекулы главного комплекса гистосовместимости первого (HLA-A, В, С) и второго классов (HLA-DP, DQ, DR), между генами Ltα и Ltβ [Глотов О.С., Баранов B.C. Генетический полиморфизм, мультифакториальные болезни и долголетие//Медицинская генетика-2007. - т.6, №4(58)-С.17-29], имеет размер 2762 п.н. и содержит 4 экзона. Последний экзон более чем на 80% кодирует белок. Известно более 30 полиморфных вариантов гена (микросателлиты, SNP-полиморфизмы), но только около половины из них влияют на экспрессию ФНО-α in vitro. Согласно литературным данным, высокопродуктивным аллелем при генетическом полиморфизме -308G/A TNFα является аллель -308А TNFα [Fernandez Н., Копеш В, Fernandes N, Hameed М, Cohen МС, Raveche Е, Cohen S. Investigation of promoter polymorphisms in the tumor necrosis factor-alpha and interleukin-10 genes in liver transplant patients. Transplantation 2002; 73: 1886-1891].

Существует три основных направления действия TNFα: цитотоксическое, направленное на клетки опухоли; иммуномодулирующее и провоспалительное, вызываемое активацией макрофагов, нейтрофилов, эозинофилов и эндотелиальных клеток; влияние на метаболизм. TNFα активно участвует в процессе быстрого увеличения размеров клетки и инициации апоптоза. Помимо прямого провоспалительного действия TNFα обладает широким спектром иммунорегуляторных эффектов и участвует в регуляции обменных процессов [Баранов B.C. Геном человека и гены «предрасположенности». (Введение в предиктивную медицину) / B.C.Баранов, Е.В.Баранова, Т.Е.Иващенко // СПБ: «Интермедика», 2000-272 с.].

В изученной научно-медицинской и доступной патентной литературе авторами не было обнаружено способа прогнозирования риска развития ангиопатии нижних конечностей у больных сахарным диабетом 2-го типа на основе данных о полиморфизме гена фактора некроза опухоли.

Для оценки сложившейся патентной ситуации был выполнен поиск по охранным документам за период с 1990 по 2012 гг. Анализ документов производился по направлению: способ прогнозирования риска развития ангиопатии нижних конечностей у больных сахарным диабетом 2-го типа на основе молекулярно-генетических данных в зависимости от полиморфных маркеров генов фактора некроза опухоли.

Известен метод для диагностики нарушений компенсации обмена веществ и способа прогнозирования риска развития осложнений у больных сахарным диабетом 2 типа на фоне апоптоза лимфоцитов по патенту РФ №2452965, опубл. 10.06.2012, «Способ диагностики нарушений компенсации обмена веществ и прогнозирования риска развития осложнений у больных сахарным диабетом 2 типа с помощью оценки апоптоза лимфоцитов». Изобретение относится к медицине, а именно к эндокринологии, и может быть использовано для диагностики нарушений компенсации обмена веществ и прогнозирования риска развития осложнений у больных сахарным диабетом 2 типа (СД 2 типа). Способ включает забор периферической венозной крови и определение процентного содержания апоптотических лимфоцитов An+/PI-, при значении содержания лимфоцитов An+/PI- ниже 3,5% диагностируется состояние компенсации углеводного обмена и прогнозируется благоприятное течение заболевания на ближайший год, при содержании лимфоцитов An+/PI- в пределах от 3,5 до 6% диагностируется состояние субкомпенсации и прогнозируется умеренный риск развития осложнений, уровень лимфоцитов An+/PI- выше 6% характеризует состояние декомпенсации и высокий риск развития хронических осложнений сахарного диабета.

Недостаток метода заключается в том, что с его помощью можно спрогнозировать только риск развития осложнений, но невозможно спрогнозировать, какое осложнение из возможных может быть у конкретного пациента.

За прототип выбран патент РФ №2461005, опубл. 10.09.2012, «Способ прогнозирования риска развития диабетической ретинопатии при сахарном диабете типа 2 у якуток», где предложен способ прогнозирования развития диабетической ретинопатии путем типирования ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови и выявления методом полимеразной цепной реакции T45G полиморфизма гена адипонектина (ADIPOQ). При выявлении генотипа *Т/*Т и аллеля *Т прогнозируют риск развития диабетической ретинопатии.

Недостаток прототипа заключается в том, что он рассматривает лишь одно из осложнений сахарного диабета 2-го типа - диабетическую ретинопатию, и предназначен только для пациентов определенной этнической принадлежности, а именно - якутов.

Задачей настоящего исследования является расширение арсенала способов диагностики, а именно создание способа прогнозирования риска развития диабетической ангиопатии нижних конечностей у индивидуумов русской национальности по данным о генетическом полиморфизме фактора некроза опухоли-α (-308G/A TNFα).

Технический результат использования изобретения - получение критериев оценки риска развития диабетической ангиопатии у индивидуумов русской национальности больных сахарным диабетом 2-го типа.

В соответствии с поставленной задачей был разработан способ прогнозирования риска развития диабетической ангиопатии у больных сахарным диабетом 2-го типа, включающий:

- выделение ДНК из периферической венозной крови;

- анализ полиморфизма гена фактора некроза опухоли (-308G/A TNFα);

- прогнозирование повышенного риска развития диабетической ангиопатии нижних конечностей у больных сахарным диабетом 2-го типа в случае выявления аллеля -308A TNFα.

Новизна и изобретательский уровень заключается в том, что из уровня техники не известна возможность прогноза риска развития ангиопатии нижних конечностей у больных сахарным диабетом 2-го типа по наличию аллеля -308А гена фактора некроза опухоли α (полиморфизм -308G/A TNFa).

Способ осуществляют следующим образом.

ДНК выделяют из образцов периферической венозной крови больных сахарным диабетом 2-го типа в 2 этапа. На первом этапе к 4 мл крови добавляют 25 мл лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5 мМ MgCl₂, 10 мМ трис-HCl (pH 7,6). Полученную смесь перемешивают и центрифугируют при 4°С, 4000 об/мин в течение 20 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (рН 8,0) и 75 мМ NaCl, ресуспензируют. Затем прибавляют 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы К (10 мг/мл) и инкубируют образец при 37°С в течение 16 часов.

На втором этапе из полученного лизата последовательно проводят экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 минут. После каждого центрифугирования производят отбор водной фазы. ДНК осаждают из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. Сформированную ДНК растворяют в бидистиллированной деионизованной воде и хранят при -20°С.

Выделенную ДНК затем подвергают полимеразной цепной реакции с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров (таблица 1).

Типирование полиморфного локуса фактора некроза опухоли α проводят методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК на амплификаторе IQ5 (Bio-Rad) с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров и зондов (табл.1) с последующим анализом полиморфизма методом дискриминации аллелей. Реакционная смесь объемом 25 мкл включает: 67 мМ трис-HCl (рН 8,8), 2,5 мМ MgCl₂, 0,1 мкг геномной ДНК, по 10 пМ каждого праймера, по 5 пмоль каждого зонда, по 200 мкМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP и 1 единицу активной Taq-полимеразы. После денатурации (5 мин. при 95°C) выполняли 40 циклов амплификации по схеме: отжиг праймеров - 1 мин. при 52°C; денатурация - 15 сек при 95°C.

Изобретение характеризуется на фиг.1, где представлена дискриминация аллелей по локусу -308G/A TNFa (где  - гомозиготы -308АА,  - гомозиготы -308GG,  - гетерозиготы -308GA,  - отрицательный контроль), которая осуществляется методом Tag Man зондов по данным величин RFU, где RFU - это уровень относительной флуоресценции (УОФ) каждого зонда. Зонд с флуоресцентным красителем ROX соответствует аллелю G, зонд с красителем FAM - аллелю А.

Две полосы, вертикальная и горизонтальная, делят график на четыре секции: одна для каждого гомозиготного состояния, одна для гетерозиготного состояния и секция без реакции. Присвоение генотипов неизвестным образцам определяется вычерчиванием RFU для одного флуорофора (на оси х) относительно RFU для другого флуорофора (на оси у) на диаграмме дискриминации аллелей.

- Если значения RFU неизвестного образца находятся выше горизонтальной полосы и правее вертикальной полосы, генотип гетерозиготен (GA).

- Если значения RFU неизвестного образца находятся выше горизонтальной полосы и левее вертикальной полосы, генотип гомозиготен по аллелю G (RFU аллеля G отложены по оси у).

- Если значения RFU неизвестного образца находятся ниже горизонтальной полосы и правее вертикальной, генотип гомозиготен по аллелю A (RFU аллеля А отложены по оси x).

- Если значения RFU неизвестного образца находятся ниже горизонтальной полосы и левее вертикальной, определение генотипа невозможно (в данном случае неопределенный образец - отрицательный контроль).

Формирование базы данных и статистические расчеты осуществлялись с использованием программы «STATISTICA 6.0». Ассоциации аллелей и генотипов изученных ДНК-маркеров с развитием ангиопатии нижних конечностей при сахарном диабете 2-го типа оценивали с помощью анализа таблиц сопряженности 2×2 с расчетом критерия χ² с поправкой Йетса на непрерывность и отношения шансов (OR) с 95% доверительными интервалами (CI) [Реброва, О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA [Текст]./ О.Ю. Реброва. - М.: Медиасфера, 2006. - 305 с.; Боровиков, В. Statistical искусство анализа данных на компьютере./ В. Боровиков. - 2-е изд. - СПб.: Питер, 2003. - 688 с.: ил. - (Для профессионалов)].

Возможность использования предложенного способа для оценки риска развития ангиопатии нижних конечностей в течении сахарного диабета 2-го типа подтверждает анализ результатов наблюдений 236 больных сахарным диабетом и 308 человек популяционного контроля. Пациенты включались в соответствующую группу больных только после установления диагноза заболевания, подтвержденного с помощью клинических и лабораторно-инструментальных методов обследования.

В исследуемую группу включались индивидуумы русской национальности, являющиеся уроженцами Центрального Черноземья России и не имеющие родства между собой.

Установлено, что пациенты с развившейся ангиопатией нижних конечностей имеют наибольшую частоту аллеля -308А TNFα (17,31%) в сравнении с контрольной группой (11,06%, χ²=5,77, p=0,02, OR=l,68, 95% CI 1,09-2,59) и больными сахарным диабетом 2-го типа без ангиопатии нижних конечностей (10,38%, χ²=4,49, p=0,03).

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о вовлеченности генетического полиморфизма -308G/A фактора некроза опухоли α в формирование ангиопатии нижних конечностей. Маркером развития ангиопатии нижних конечностей у больных СД2 является аллель -308А TNFα. Больным сахарным диабетом 2-го типа при выявлении генетического фактора риска развития ангиопатии нижних конечностей (-308А TNFα) следует рекомендовать динамический контроль состояния сосудов нижних конечностей (определение пульсации периферических артерий, ультразвуковая допплерография и допплерометрия сосудов нижних конечностей) с целью ранней диагностики и своевременного лечения ангиопатии нижних конечностей у больных сахарным диабетом 2-го типа (применение сосудистых препаратов, антикоагулянтов, гиполипидемической терапии).

Формула изобретения

Способ прогнозирования риска развития ангиопатии нижних конечностей у больных сахарным диабетом 2-го типа, включающий выделение ДНК из периферической венозной крови, отличающийся тем, что проводят анализ полиморфизма гена фактора некроза опухоли -308G/A TNFα и прогнозируют повышенный риск развития ангиопатии нижних конечностей у больных сахарным диабетом 2-го типа в случае выявления аллеля -308A TNFα.

Изобретение "СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА РАЗВИТИЯ ДИАБЕТИЧЕСКОЙ АНГИОПАТИИ НИЖНИХ КОНЕЧНОСТЕЙ У БОЛЬНЫХ САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ 2 ТИПА" (Чурносов Михаил Иванович, Белоусова Оксана Николаевна, Сиротина Светлана Сергеевна, Чурносова Юлия Юрьевна) отмечено юбилейной наградой (25 лет Российской Академии Естествознания)
Медаль Альфреда Нобеля

Оформление наградных документов и заказ каталога