БИОПРЕПАРАТ ДЛЯ ОЧИСТКИ ВОДЫ, ПОЧВЫ И ПРОМЫШЛЕННЫХ СТОКОВ ОТ УСТОЙЧИВЫХ К РАЗЛОЖЕНИЮ ПЕСТИЦИДОВ И СПОСОБ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ

Название	БИОПРЕПАРАТ ДЛЯ ОЧИСТКИ ВОДЫ, ПОЧВЫ И ПРОМЫШЛЕННЫХ СТОКОВ ОТ УСТОЙЧИВЫХ К РАЗЛОЖЕНИЮ ПЕСТИЦИДОВ И СПОСОБ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ
Разработчик (Авторы)	Анисимова Лилия Георгиевна, Маркушева Татьяна Вячеславовна, Кураков Александр Васильевич, Закутаев Андрей Петрович
Вид объекта патентного права	Изобретение
Регистрационный номер	2484131
Дата регистрации	13.07.2011
Правообладатель	Общество с ограниченной ответственностью "БИОЛЭНД"
Область применения (класс МПК)	C12N 1/26 (2006.01), C02F 3/34 (2006.01), B09C 1/10 (2006.01), C12R 1/125 (2006.01), C12R 1/01 (2006.01), C12R 1/40 (2006.01)

Описание изобретения

Изобретение относится к новому биопрепарату для очистки воды, почвы и промышленных стоков, загрязненных стойкими к разложению химическими веществами, относящимися к категории опасных, таких как широко применяемые в сельском хозяйстве пестициды.

Биопрепараты-биодеструкторы и их использование для очистки почв и грунтов от нефти и нефтепродуктов, содержащие Bacillus brevis и Arthrobacter species, описаны в патентах РФ 2323970 и 2237711, а в патенте РФ 2086667 описан консорциум, включающий микроорганизмы Pseudomonas putida и Bacillus subtilis.

Известны также биопрепараты "Родер" на основе штаммов Rhodococcus ruber ВКМ Ас-1513Д и Rhodococcus erythropolis ВКМ Ас-1514Д, «Ленойл», «Деворойл», "Экобел" на основе штаммов бактерий штаммов Pseudomonas и дрожжей, которые эффективно применяются для удаления алифатических фракций нефти.

Известно разложение хлорированных ароматических пестицидов (2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты и 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоты) с помощью бактерий Pseudomonas pseudoalcaligenes штамм NRRL В-18087 (патент США 4804629), детоксикация остатков фосфорорганических пестицидов и их токсичных метаболитов штаммом бактерии Agrobacterium radiobacter (авт. свид. СССР 1250572). В авт. свид. СССР 1560487 описывается способ деструкции пестицида 3,4-дихлоранилида водорослями Chlorella vulgaris БКМ-А-10 и Scenedesmus acuminalus УА-2-7а. Разложение 2-хлорбензойной кислоты бактериями Pseudomonas putida YNK-1 описывается в патенте США 4803166; фосфатных примесей и хлорированных углеводородов - микроорганизмами Moraxella и Arthrobacter отдельно или в комбинации - в патенте ФРГ 3729127. Известна деструкция таких соединений, как ДДТ, полихлорфенолы, бензопирены, диоксины, с помощью базидиального гриба Phanerochate chrysosporium (патент США 4891320). Штамм Pseudomonas putida - 106 является активным деструктором диметилфенилкарбинола и фенола (3), бактерии Pseudomonas pseudoacaligenes разрушают ароматические и гетероциклические соединения, чаше всего обнаруживаемые в сточных водах (5), а штамм Pseudomonas pseudoacaligenes разрушает ароматические соединения в твердой и жидкой среде (4). Способностью к деструкции хлоропроизводных триазина, таких как симазин и атразин, обладают некоторые музейные штаммы Nocardia, Arthrobacter, Micromonospora (6). В патенте США 6632363 описывается композиция, содержащая гидрофобный носитель и бактерии Bacillus subtilis, и способ ее использования для улучшения качества воды, содержащей, например, пестициды.

Ксенофонтова О.Ю. и др. в статье «Изменение численности почвенных микроорганизмов под действием пестицидов» (Известия Саратовского Госуниверситета, Научн. Секция «Химия, биологич. Экология», 2007, т.7, №2, с.66) описывает в качестве наиболее активных деструкторов штаммы аэробных бактерий из родов Bacillus и Pseudomonas, разрушающие следующие пестициды: хлортиазид, юглон, семихинона, нитролон, картоцид и каратэ.

В патенте РФ 2410170 описывается способ очистки загрязненного грунта от органических соединений, в том числе от пестицидов, например от дихлорбифенила (ДХБ), путем внесения сорбента, представляющего собой глаутонитовую породу, предварительно обработанную при 200-300°С, и штамма бактерий рода Rhodococcus.

Во всех описанных способах детоксикации ядохимикатов (токсичных веществ) для разложения конкретных химических соединений предлагаются определенные виды микроорганизмов. Описывается в основном разложение ядохимикатов в водной среде при использовании ксенобиотиков микроорганизмами в качестве единственного источника углерода и энергии, либо требуется дополнительное использование сорбентов.

Существенным недостатком всех вышеперечисленных культур является их узкая специфичность к определенному субстрату, и они не имеют препаративной формы и не применяются на практике для очистки загрязненных трудноразлагаемыми химическими соединениями, такими как пестициды, вод, промышленных стоков и почв.

В патенте РФ 2093478 описана ассоциация штаммов бактерий Pseudomonas putida BKM 1301, Bacillus subtilis BKM B-1742D и Rhodococcus erythropolis BKM Ac-1339D в соотношении 1:1:1 для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов и полимерных добавок в буровом растворе и ее использование. Однако использование указанной ассоциации для очистки воды, почвы и промышленных стоков, загрязненных стойкими к разложению химическими веществами, такими как пестициды, ранее не было известно.

Наиболее близким к препарату настоящего изобретения по назначению является биопрепарат «Биава» (патент РФ 2248255), который способствует повышению почвенного плодородия и стимулированию естественной микрофлоры среды. Биопрепарат содержит амилолитические, протеолитические и азотфиксирующие микроорганизмы, такие как микроорганизмы рода Pseudomonas, Bacillus. Недостатком этого препарата является сложный состав, включающий более 25 видов разных микроорганизмов, не адаптированых к ассоциативным взаимодействиям, что является сложным в производстве и для поддержания штаммов. В указанном патенте также описывается способ применения биопрепарата «Биава» введением последнего в почву.

Данный препарат не является стимулятором роста растений и не обладает способностью к разложению таких стойких химических веществ, как пестициды или гербициды из ряда хлорфеноксиуксусных кислот: 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д), трихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4,5,-Т), фенола, 2,4-дихлорфенола, ХФУК и ряда других химических соединений, описываемых ниже. Данные соединения являются одними из наиболее стойких и персистентных в окружающей среде. Попадание в организм таких химических веществ может привести к тяжелым заболеваниям органов, тканей и нервной системы. Присутствие их в продуктах питания считается недопустимым (см., например, Тинсли И. Поведение химических загрязнителей в окружающей среде. Пер. С англ. М.: Мир, 1992, с.281).

Задачей настоящего изобретения является разработка нового биопрепарата для очистки (детоксикации) почвы, воды и промышленных стоков загрязненных стойкими химическими веществами, такими как пестициды, фенолы, а также способ применения препарата. Препарат ФЕНОКС согласно настоящему изобретению улучшает очистку среды от токсичных соединений и, как следствие, повышает потребительское качество продуктов, выращенных на обработанной земле. При этом происходит микробиологическая деструкции токсичных веществ клетками бактерий в почве до неопасных соединений. Биопрепарат проявляет высокую эффективность при очистке сточных вод промышленных предприятий.

Настоящее изобретение относится к биопрепарату ФЕНОКС для очистки грунта, почвы, промышленных стоков от устойчивых к разложению химических веществ, таких как пестициды, который представляет собой ассоциацию новых штаммов бактерий Pseudomonas putida. Bacillus subtilis и Rhodococcus erythropolis в массовом соотношении (1-2):(1-2):(1), который может дополнительно содержать сорбент или иммобилизован на сорбенте, минеральные, органические и стимулирующие добавки.

Отличием предлагаемого препарата «ФЕНОКС» от ранее известного ближайшего аналога по назначению является указанная ассоциация штаммов бактерий в указанном массовом соотношении.

Препарат особенно эффективен при использовании его для разложения устойчивых пестицидов, выбранных из группы хлорфеноксиуксусных кислот, таких как 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д), трихлорфеноксиуксусная кислота (2,4,5-Т), 2,4-дихлорфенокси-α-пропионовая (Дихлорпроп, 2,4-ДР), 2-метил-4-хлорфенокси-α-пропионовая (Мекопроп, 2М-4ХП, МСРР), 2,4,5-трихлорфенокси-α-пропионовая (2,4,5-ТР, Silvex), 2,4-дихлорфенокси-α-масляная (2,4-ДВ); метил-[1-[(бутиламино)карбонил]-1Н-бензимидазол-2-ил]карбамат и препарата на его основе (беномил, carbendazin, беназол); имидор, где действующим веществом является неоникотиноид имидоклаприд, imidacloprid; зонтран, где действующим веществом является метрибузин (metribuzin), ГХЦГ (гексахлорциклогексан, гексахлоран, гексатокс, долмикс, синекс), ХФУК (хлорфеноксиуксусная кислота), ФУК (феноксиуксусная кислота), гексахлорфенол, 1,1-ди(4'-хлорфенил)-2,2-дихлорэтан (ДДТ, дуст), а также 2,4-дихлорфенол и фенола. Особенно препарат эффективен при использовании его для разложения устойчивых пестицидов из группы хлорфеноксиуксусных кислот, таких как - 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д), трихлорфеноксиуксусная кислота (2,4,5-Т), хлорфеноксиуксусной кислоты (ХФУК), феноксиуксусная кислота (ФУК), а также 2,4-дихлорфенола и фенола, имидоклаприда.

Препарат настоящего изобретения также в отличие от ранее известных препаратов обладает дополнительно ростстимулирующим действием на прорастание семян и рост культурных растений, а также обладает фунгицидной активностью.

Объектом изобретения также является способ применения указанного биопрепарата «Фенокс». Способ заключается во введении в эффективном количестве препарата в загрязненный грунт, почву или промышленный сток.

Отличием предлагаемого способа применения от ранее известного ближайшего аналога является введение ассоциации указанных штаммов бактерий в указанном массовом соотношении.

Предпочтительно препарат вводят в количестве 10 кг сухого вещества в момент вспашки из расчета на 1 га земли при температуре окружающей среды, преимущественно при температуре 15-35 С°. Наиболее предпочтительны методы введения в виде водного раствора путем дождевания. Можно также осуществлять введение препарата в почву введением семян, обработанных суспензией препарата с добавлением биогенных элементов, таких как вермикомпост, или введением сухой препаративной формы препарата в виде порошка в землю в момент вспашки или высева семян.

Либо введение препарата можно осуществлять посевом в почву семян, обработанных суспензией препарата с добавлением биогенных элементов, таких как вермикомпост.

Предварительно препарат разводят в резервуаре с водой с добавлением вермикомпоста, азотно-фосфорных удобрений.

Возможно также введение сухой препаративной формы препарата в виде порошка в землю в момент вспашки или высева семян. Предлагаемый согласно настоящему изобретению препарат «ФЕНОКС» обладает стимулирующим эффектом на рост растений и штаммы препарата хорошим приживанием в почве, что обуславливает эффективную детоксикацию среды. Штаммы Pseudomonas putida и Rhodococcus erythropolis несут D-плазмиды деградации и способны передавать свойство разрушения пестицидов, а также других вредных веществ аборигенным бактериальным популяциям почвы, воды, стоков, усиливая тем самым ее очистку от загрязнителей. Преимуществом применения данного препарата является разложение пестицидов в почве до 86% и в жидкой среде до 99%.

Действующая основа препарата - ассоциация почвенных штаммов бактерий Pseudomonas putida, Bacillus subtilis, Rhodococcus erythropolis. Все культуры обладают полисубстратной специфичностью одновременно к нескольким ксенобиотикам: хлорфеноксиуксусным кислотам, таким как 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д), трихлорфеноксиуксусная кислота (2,4,5-Т), фенол, 2,4-дихлорфенол, ХФУК и ряда других, указанных в примерах. Их смешение дает усиление функции очистки среды от токсичных соединений. В качестве сорбентов используется каолин и мелкоразмельченный торф, который одновременно служит органической добавкой, в качестве органо-минеральной и рост-стимулирующей добавки вермикомпост, экстракт из него и хитинсодержащие субстраты. Перед применением в емкости (ведре, фляге) сухой порошок препарата хорошо перемешивают в теплой воде (25-30°С) до получения однородной суспензии. 10 г препарата размешивают в 10 л воды. Рекомендуется добавить азофоски (5 г/10 л) или компоста (5 г/10 л), периодически суспензию перемешивают для аэрации и активизации микроорганизмов в течение 1-3 часов перед использованием (полива из лейки почвы (10-20 л/10 м²) или обработки 100-150 мл/100 г семян).

Получение биопрепарата реализуется путем раздельного глубинного культивирования обычно в течение около 20-30 часов 3 штаммов указанных высокоэффективных бактерий на стандартном биотехнологическом оборудовании. Посевной материал получают выращиванием штаммов на синтетической среде с добавлением пестицида и используют этот материал для засева ферментеров большого объема.

Наращенная сухая биомасса клеток смешивается в соотношении (1-2):(1-2):1. Общий титр составляет не менее 5×10⁸ КОЕ/г сухого препарата после добавления носителя-сорбента и других добавок (исходного концентрата 10^10-11 и не менее 5×10⁸ КОЕ/мл жидкого препарата. Для промышленного производства и расфасовки предлагаемого препарата используется типовое биотехнологическое и фасовочное оборудование и материалы.

Биопрепарат устраняет поступление в растения, овощи и ягоды химических средств защиты растений, стимулирует прорастание семян и рост растений, ингибирует грибные фитопатогены.

ФЕНОКСом обрабатывают загрязненную химическими веществами, такими как пестициды, фенол, возможно нефтью воду, промышленные стоки, почву, а также семена растений.

Штаммы, входящие в Фенокс, являются новыми.

Штамм Bacillus subtilis выделен методом накопительных культур из образцов почв промышленной зоны предприятий химичекой промышленности Южного Урала. Штамм Bacillus subtilis депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под номером ВКПМ В-10999.

Штамм Bacillus subtilis идентифицирован на основе анализа нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК. Нуклеотидная последовательность (длинной не меньше 500 пар оснований) фрагмента ДНК, кодирующего ген 16S рРНК, имеет сходство с заявленным видом, составляющее 99%.

Культурально-морфологические признаки

Штамм Bacillus subtilis имеет типичные для этого вида Культурально-морфологические признаки. Палочки, размером 0,2-0,5 на 1,5-3 мкм, одиночные, часто в парах. Образуют овальные и округлые эндоспоры. Жгутики расположены пеитрихально. При росте на мясо-пептонном бульоне культура образует развитую матовую пленку, среда при этом остается прозрачной. При встряхивании биомассы в жидкой среде ее полного диспергирования не происходит. Колонии сухие мелкоморщинистые, край волнистый. На ломтиках картофеля рост обилен в виде колоний кремового цвета гладких, сильно крупноскладчатых. Окраска по Грамму положительная.

Физиолого-биохимические признаки

Штамм Bacillus subtilis хорошо растет на глюкозо-пептонной среде, LB агаре и бульоне, глюкозо-минеральной среде при температуре 28°С. Растет на средах с L-пролином, DL-лейцином, α-кетоглутаратом, DL-α-аланином, L-глутамином, D(+)-ксилозой, L-аспарагином, хитином, DL-серином, глюкозой, фенолом и хлорфеноксикарболовыми кислотами в качестве единственного источника углерода. Штамм Bacillus subtilis может храниться в лиофилизированном состоянии. Проверка жизнеспособности штамма проводится высевом на глюкозо-пептонный агар, М9 и LB - 1 раз в 12 месяцев. При хранении на косяках с этими средами при 5°С - пересев 1 раз в 3 месяца.

Штамм Bacillus subtilis является непатогенным и нетоксичным микроорганизмом. При внутривенном заражении белых мышей не проявляет зоопатогенных свойств.

Штамм Rhodococcus erythropolis выделен методом накопительных культур из образцов почв промышленной зоны предприятий химичекой промышленности Южного Урала. Штамм Rhodococcus erythropolis депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под номером ВКПМ Ас-1882.

Штамм Rhodococcus erythropolis идентифицирован на основе анализа нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК. Нуклеотидная последовательность (длинной не меньше 500 пар оснований) фрагмента ДНК, кодирующего ген 16S рРНК, имеет сходство с заявленным видом, составляющее 99%.

Культурально-морфологические признаки

Штамм Rhodococcus erythropolis имеет типичные для этого вида культурально-морфологические признаки. Клетки палочковидные, редко ветвящиеся, диаметр составляет 0,6-0,8 мкм, длина - 3-8 мкм. Клетки умеренно полиморфные, часто расположены в виде V-форм, имеют выраженный цикл развития кокк-палочка-кокк: в возрасте 24-36 часов палочковидные клетки начинают укорачиваться и увеличивается доля кокковидных и овальных клеток. Зрелые колонии пигментированные, имеют оранжевую краску. Консистенция колоний пастообразная. Окраска по Грамму положительная.

Физиолого-биохимические признаки

Штамм Rhodococcus erythropolis хорошо растет на глюкозо-пептонной среде, LB агаре и бульоне, глюкозо-минеральной среде при температуре 28°С. Растет на средах с L-пролином, D-арабинозой, DL-α-аланином, L-глутамином, D(+)-ксилозой, L-аспарагином, DL-серином, казеином, глюкозой, фенолом и хлорфеноксикарболовыми кислотами в качестве единственного источника углерода. Штамм Rhodococcus erythropolis может храниться в лиофилизированном состоянии. Проверка жизнеспособности штамма проводится высевом на глюкозо-пептонный агар, М9 и LB - 1 раз в 12 месяцев. При хранении на косяках с этими средами при 5°С - пересев 1 раз в 3 месяца.

Штамм Rhodococcus erythropolis является непатогенным и нетоксичным микроорганизмом. При внутривенном заражении белых мышей не проявляет зоопатогенных свойств.

Штамм Pseudomonas putida выделен методом накопительных культур из образцов почв промышленной зоны предприятий химической промышленности Южного Урала. Штамм Pseudomonas putida депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под номером ВКПМ В-10997.

Штамм Pseudomonas putida идентифицирован на основе анализа нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК. Нуклеотидная последовательность (длиной не меньше 500 пар оснований) фрагмента ДНК, кодирующего ген 16S рРНК, имеет сходство с заявленным видом составляет 99%.

Культурально-морфологические признаки

Штамм Pseudomonas putida имеет типичные для этого вида культурально-морфологические признаки. Подвижные палочки с полярно расположенными жгутиками. Размер клеток составляет 1-4 на 1,3-5,4 мкм. Колонии на мясо-пептонном агаре сероватого цвета, в пределах колоний и с их обратной стороны наблюдается красновато-буроватый пигмент. Спор не образуется. Консистенция колоний - тягучая. Окраска по Грамму отрицательная.

Физиолого-биохимические признаки

Штамм Pseudomonas putida хорошо растет на глюкозо-пептонной среде, LB агаре и бульоне, глюкозо-минеральной среде при температуре 28°С. Растет на средах с DL-тирозином, DL-триптофаном, D(+)-ксилозой, D(-)-маннитом, L-глутаминовой кислотой, DL-лейцином, α-кетоглутаратом, DL-α-аланином, D-рибозой, L(+)-арабинозой, L-глутамином, целлюлозой, L-аспарагином, хитином, DL-серином, пектином, глюкозой, казеином, фенолом и хлорфеноксикарболовыми кислотами в качестве единственного источника углерода. Штамм Pseudomonas putida может храниться в лиофилизированном состоянии. Проверка жизнеспособности штамма проводится высевом на глюкозо-пептонный агар, М9 и LB - 1 раз в 12 месяцев. При хранении на косяках с этими средами при 5°С - пересев 1 раз в 3 месяца.

Штамм Pseudomonas putida является непатогенным и нетоксичным микроорганизмом. При внутривенном заражении кроликов не проявляет зоопатогенных свойств.

Формула изобретения

1. Биопрепарат для очистки грунта, почвы, промышленных стоков от устойчивых к разложению пестицидов, выбранных из хлорфеноксиуксусных кислот -2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д), трихлорфеноксиуксусная кислота (2,4,5-Т), хлорфеноксиуксусная кислота (ХФУК), феноксиуксусная кислота (ФУК), -2,4-дихлорфенокси-α- пропионовой кислоты, 2-метил-4-хлорфенокси-α-пропионовой кислоты, 2,4,5-трихлорфенокси-α-пропионовой кислоты, 2,4-дихлорфенокси-α-масляной кислоты, метил-[1-(бутиламино)карбонил]-1Н-бензимидазол-2-илкарбамата, 2,4-дихлорфенола, имидоклаприда, гексахлоргексана, а также фенола, представляющий собой ассоциацию штаммов бактерий Pseudomonas putida ВКПМ В-10997, Bacillus cubtilis ВКПМ В-10999, u Rhodococcus erythropolis ВКПМ-Ac-1882 в массовом соотношении (1-2):(1-2):1.

2. Биопрепарат по п.1, содержащий дополнительно сорбент и возможно минеральные, органические и стимулирующие добавки.

3. Биопрепарат по п.1 или 2 для очистки грунта, почвы, промышленных стоков от устойчивых к разложению пестицидов, выбранных из хлорфеноксиуксусных кислот, таких как -2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д), трихлорфеноксиуксусная кислота (2,4,5-Т), хлорфеноксиуксусной кислоты (ХФУК), феноксиуксусная кислота (ФУК), а также 2,4-дихлорфенола и фенола, имидоклаприда.

4. Биопрепарат по п.1, дополнительно обладающий ростстимулирующим и фунгицидным действием.

5. Способ применения биопрепарата для очистки грунта, почвы, промышленных стоков от устойчивых к разложению пестицидов, выбранных из хлорфеноксиуксусных кислот -2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д), трихлорфеноксиуксусная кислота (2,4,5-Т), хлорфеноксиуксусная кислота (ХФУК), феноксиуксусная кислота (ФУК), -2,4-дихлорфенокси-α-пропионовой кислоты, 2-метил-4-хлорфенокси-α-пропионовой кислоты, 2,4,5-трихлорфенокси-α-пропионовой кислоты, 2,4-дихлорфенокси-α-масляной кислоты, метил-[1-(бутиламино)карбонил]-1Н-бензимидазол-2-илкарбамата, 2,4-дихлорфенола, имидоклаприда, гексахлоргексана, а также фенола, введением в загрязненный грунт, почву или промышленный сток препарата по любому из пп.1 или 2 в эффективном количестве.

6. Способ по п.4, отличающийся тем, что препарат вводят в количестве 10 кг сухого вещества в момент вспашки из расчета на 1 га земли.

7. Способ по п.4, отличающийся тем, что препарат вводят в виде водного раствора путем дождевания.

Изобретение "БИОПРЕПАРАТ ДЛЯ ОЧИСТКИ ВОДЫ, ПОЧВЫ И ПРОМЫШЛЕННЫХ СТОКОВ ОТ УСТОЙЧИВЫХ К РАЗЛОЖЕНИЮ ПЕСТИЦИДОВ И СПОСОБ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ" (Анисимова Лилия Георгиевна, Маркушева Татьяна Вячеславовна, Кураков Александр Васильевич, Закутаев Андрей Петрович) отмечено юбилейной наградой (25 лет Российской Академии Естествознания)
Медаль Альфреда Нобеля

Оформление наградных документов и заказ каталога