БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ СПОСОБ МОНИТОРИНГА РАДИОТОКСИЧНОСТИ РАСТВОРА

Название	БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ СПОСОБ МОНИТОРИНГА РАДИОТОКСИЧНОСТИ РАСТВОРА
Разработчик (Авторы)	Кудряшева Надежда Степановна, Кратасюк Валентина Александровна, Рожко Татьяна Владимировна, Болсуновский Александр Яковлевич, Бондарева Лидия Георгиевна
Вид объекта патентного права	Изобретение
Регистрационный номер	2311462
Дата регистрации	21.09.2006
Правообладатель	Кудряшева Надежда Степановна, Кратасюк Валентина Александровна
Область применения (класс МПК)	C12Q 1/26 (2006.01)
Медаль имени А.Нобеля

Описание изобретения

Изобретение относится к области экологического биомониторинга и радиоэкологии и может быть использовано для определения радиотоксичности растворов.

Известен способ определения концентрации ингибиторов биологической активности, включающий обработку анализируемой пробы реакционной смесью, содержащей люциферазу и ее субстраты, измерение максимума биолюминесценции, по величине которого определяют концентрацию ингибитора [А.с. №865904, МПК С12Q 1/26, опубл. 23.09.81 г., бюл. №35].

Известен способ определения концентрации ингибиторов биологической активности, включающий обработку анализируемой пробы реакционной смесью, содержащей альдегид и НАДН в насыщающих концентрациях, люциферазу, НАДН: ФМН-оксидоредуктазу и ФМН и определение концентрации по величине интенсивности свечения [А.с. №1204639, МПК С12Q 1/26, опуб. 15.01.86 г., бюл. №2, прототип].

Недостатками этих способов являются низкая чувствительность определения концентрации ингибиторов биологической активности (до 10^-11 моль/л) и отсутствие возможности проводить анализ растворов радионуклидов.

Техническим результатом изобретения является разработка высокочувствительного способа определения радиотоксичности в растворах, содержащих радиоактивные элементы.

Технический результат достигается тем, что в биолюминесцентном способе мониторинга радиотоксичности растворов, включающем приготовление рабочей и контрольной биолюминесцентных проб, обработку реакционным раствором и измерение интенсивности биолюминесценции, новым является то, что рабочую пробу обрабатывают солевым раствором, содержащим радионуклиды, а в контрольную пробу добавляют солевой раствор и для накопления радиоактивного эффекта инкубируют пробы в течение 2-15 суток в одинаковых условиях при температуре ниже 20°С.

Сопоставительный анализ с прототипом показывает, что заявляемый способ отличается от известного тем, что рабочую пробу обрабатывают раствором, содержащим радионуклиды и для накопления радиоактивного эффекта инкубируют (выдерживают) пробы в течение 2-15 суток в одинаковых условиях при температуре ниже 20°С. Таким образом, заявляемый способ соответствует критерию «новизна».

Известны технические решения, где использовались биолюминесцентные способы определения радиотоксичности, вызываемой гамма-излучением, с использованием светящихся бактерий [J.Min, С.W.Lee and M.В.Gu. Gamma-radiation dose-rate effects on DNA damage and toxicity in bacterial cells, Radiat EnvironBiophys, 2003, 42, 189, 192]. Однако чувствительность предлагаемого способа недостаточна для измерения малых и сверхмалых радиоактивностей. Накопление дозы облучения в результате процедуры инкубирования дает возможность расширить диапазон анализа радиотоксичности в сторону низких активностей и количественно оценить радиотоксичность, а это не известно из уровня техники и позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого решения критерию «изобретательский уровень».

На фиг.1 приведены зависимости биолюминесцентного индекса (БИ) от времени выдерживания пробы на основе клеточной суспензии 16 часовой культуры P.Phosphoreum 1883 IBSO суспензий для 3-х концентраций раствора америция: 1 - 10^-15 M; 2 - 10^-16 M; 3 - 10^-17 M.

На фиг.2 показаны величины БИ_макс и БИ_мин для трех типов тестовых систем (1 - интактные бактерии; 2 - лиофильно высушенные бактерии; 3 - система сопряженных ферментативных реакций) для 3-х концентраций нитрата америция: 10^-15 М (черный цвет), 5·10^-16 М (серый цвет) и 10^-17 М (белый цвет), соответствующих удельным активностям растворов 6000 Бк/л, 3000 Бк/л и 60 Бк/л.

Заявляемый биолюминесцентный способ мониторинга радиотоксичности растворов осуществляется следующим образом: вначале готовят рабочую и контрольную пробы. Для приготовления рабочей пробы к суспензии бактерий или ферментов добавляют раствор радионуклидов (например, америция, урана или других радиоактивных элементов в солевом растворе NaNO₃, NaCl или др.). Для приготовления контрольной пробы к суспензии бактерий или ферментов добавляют только солевой раствор NaNO₃, NaCl или другой этой же концентрации. Пробы выдерживают (инкубируют) в одинаковых условиях при постоянной температуре ниже +20°С. Затем через определенные промежутки времени, например 0.5; 1; 1.5; 2; 2.5; 3; 4; 6; 8; 16; 24; 24 и т.д. часов, отбирают 10-50 мкл рабочей и контрольной суспензий для приготовления рабочего и контрольного растворов соответственно (приготовление растворов дано в примерах). Далее измеряют интенсивность биолюминесценции рабочего и контрольного растворов с помощью биолюминометра при температуре 10-35°С. Приготовление растворов и измерение интенсивности биолюминесценции продолжают до падения интенсивности биолюминесценции контрольного раствора на 80%. Данное ингибирование достигается в течение 2-15 суток (примеры 1-3). Необходимое время инкубирования уменьшается в следующем ряду биолюминесцентных тестовых систем: 1 - интактные бактерии; 2 - лиофильно высушенные бактерии; 3 - система сопряженных ферментативных реакций. Время инкубирования зависит от температуры выдерживания пробы: чем выше температура, тем меньше время инкубирования. Для каждого времени инкубирования рассчитывается биолюминесцентный индекс (БИ):

где:

I_Р - интенсивность биолюминесценции в рабочем растворе;

I_К - интенсивность биолюминесценции в контрольном растворе.

Строится зависимость БИ от времени инкубирования проб. На фиг.1 показаны величины БИ_макс и БИ_мин соответственно для 3-х концентраций радиоактивного раствора нитрата америция (III): 10^-15 М - кривая 1; 5·10^-16 М - кривая 2; 10^-17 М - кривая 3. Чем выше БИ_макс и ниже БИ_мин, тем выше радиотоксичность раствора. Таким образом, величины БИ_макс и БИ_мин характеризуют влияние радиации на разные биолюминесцентные тестовые системы. При переходе от бактерий (1 на фиг.2) к ферментативным системам (3 на фиг.2) понижается чувствительность, такая же зависимость наблюдается и при переходе от целых бактериальных клеток (1 на фиг.2) к поврежденным при лиофильной сушке в процессе приготовлении коммерческого препарата (2 на фиг.2).

При использовании в качестве радиоактивного раствора нитрата уранила UO₂(NO₃)₂ способ осуществляется при тех же концентрациях и температурах инкубирования, что и в случае нитрата америция ²⁴¹Am(NO₃)₃, с теми же биолюминесцентными тестовыми системами. Получены аналогичные зависимости БИ от времени инкубирования.

Пример 1. Для приготовления рабочей пробы в качестве биолюминесцентной тестовой системы используют клеточную суспензию 16 часовой культуры Photobacterium Phosphoreum 1883 IBSO или Photobacterium leiognathi, добавляют радиоактивный раствор ²⁴¹Am(NO₃)₃ в 1.1 М растворе NaNO₃. Одновременно готовится контрольная проба путем добавления к этой же культуре бактерий 1.1 М раствора NaNO₃. Обе пробы выдерживают в одинаковых условиях при постоянной температуре +4°С. Затем через определенные промежутки времени (от 0.5 часа в начале эксперимента до 24 часов к концу эксперимента) отбирают 10-50 мкл обеих проб для приготовления рабочего и контрольного растворов. Состав рабочего и контрольного растворов следующий: 50 мкл рабочей или контрольной пробы, 500 мкл 3% раствора NaCl. Далее измеряют интенсивность биолюминесценции рабочего и контрольного растворов с помощью биолюминометра. Приготовление растворов и измерение интенсивности продолжают до 80%-го ингибирования биолюминесценции контрольного раствора в течение 15 суток при температуре 20°С. Для каждого времени инкубирования рассчитывается БИ, строится зависимость биолюминесцентного индекса от времени инкубирования проб (фиг.1). Записываются значения БИ_макс и БИ_мин, по величине которых делаются выводы о радиотоксичности раствора.

Пример 2. Для приготовления рабочей пробы в качестве биолюминесцентной тестовой системы используют препарат Микробиотест 677 F, изготовленный на основе лиофилизированных светящихся бактерий P.Phosphoreum 1883 IBSO, к которому добавляют радиоактивный раствор ²⁴¹Am(NO₃)₃ в 1.1 М растворе NaCl. Одновременно готовится контрольная проба путем добавления к билюминесцентной тестовой системе 1.1 М раствора NaCl. Обе пробы выдерживают в одинаковых условиях при постоянной температуре +4°С. Затем через определенные промежутки времени (от 0.5 часа в начале эксперимента до 16 часов к концу эксперимента) отбирают 10-50 мкл обеих проб для приготовления рабочего и контрольного растворов. Состав рабочего и контрольного растворов готовят следующим образом: 50 мкл суспензии бактерий (с америцием или без него), 500 мкл 3% раствора NaCl. Далее измеряют интенсивность биолюминесценции рабочего и контрольного растворов с помощью биолюминометра. Приготовление растворов и измерение интенсивности продолжают в течение 10 суток (до 80%-го ингибирования биолюминесценции контрольного раствора) при температуре 20°С. Для каждого времени инкубирования рассчитывается биолюминисцентный индекс и строится зависимость БИ от времени инкубирования проб. Записываются значения БИ_макс и БИ_мин, по величине которых делаются выводы о радиотоксичности раствора.

Пример 3. Для приготовления рабочей пробы в качестве биолюминесцентной тестовой системы используют комплект Реактивов Аналитической Биолюминесценции (КРАБ). Он включает лиофилизированные препараты люциферазы (0.5 мг/мл) и НАДН:ФМН-оксидоредуктазы (0.15 ед. активности). Для приготовления рабочей пробы к КРАБу добавляют радиоактивный раствор ²⁴¹Am(NO₃)_з в 1.1 М растворе NaNO₃. Одновременно готовится контрольная проба путем добавления к КРАБу 1.1 М раствора NaNO₃. Обе пробы выдерживают в одинаковых условиях при постоянной температуре -4°С. Затем через определенные промежутки времени (от 0.5 часа в начале эксперимента до 6 часов к концу эксперимента) отбирают 10-50 мкл обеих проб для приготовления рабочего и контрольного растворов. Состав рабочего и контрольного растворов следующий: 10 мкл раствора рабочей и контрольной пробы, 50 мкл 0.0025% раствора тетрадеканаля, 200 мкл 0.05 М калий-фосфатного буфера, 50 мкл 5·10^-4 М раствора ФМН, 200 мкл 4·10^-4 М раствора НАДН. Общий объем смеси - 500 мкл. Реакцию запускают раствором НАДН. Далее измеряют интенсивность биолюминесценции рабочего и контрольного растворов с помощью биолюминометра. Приготовление растворов и измерение интенсивности продолжают до заметного ингибирования биолюминесценции рабочего раствора в течение 2 суток (до 80%-го ингибирования биолюминесценции контрольного раствора) при температуре 20°С. Для каждого времени инкубирования рассчитывается биолюминисцентный индекс и строится зависимость БИ от времени инкубирования проб. Записываются значения БИ_макс и БИ_мин, по величине которых делаются выводы о радиотоксичности раствора.

Пример 4. Для приготовления рабочей пробы в качестве биолюминесцентной тестовой системы используют клеточную суспензию 16 часовой культуры бактерий Photobacterium Phosphoreum 1883 IBSO или Photobacterium leiognathi, добавляют радиоактивный раствор UO₂(NO₃)₂ в 1.1 М растворе NaCl. Одновременно готовится контрольная проба путем добавления к этой же суспензии бактерий 1.1 М раствора NaCl. Обе пробы выдерживают в одинаковых условиях при постоянной температуре +4°С. Затем через определенные промежутки времени (от 0.5 часа в начале эксперимента до 24 к концу эксперимента) отбирают 10-50 мкл обеих проб для приготовления рабочего и контрольного растворов. Состав рабочего и контрольного растворов следующий: 50 мкл рабочей или контрольной пробы, 500 мкл 3% раствора NaCl. Далее измеряют интенсивность биолюминесценции рабочего и контрольного растворов с помощью биолюминометра. Приготовление растворов и измерение интенсивности продолжают до 80%-го ингибирования биолюминесценции контрольного раствора в течение 15 суток при температуре 20°С. Для каждого времени инкубирования рассчитывается БИ, строится зависимость БИ от времени инкубирования проб. Записываются значения БИ_макс и БИ_мин, по величине которых делаются выводы о радиотоксичности раствора.

Заявляемый биолюминесцентный способ мониторинга радиотоксичности растворов является не дорогим, высокочувствительным (позволяет давать количественную оценку радиотоксичности до 60 Бк/л, что соответствует концентрации, например, америция 10^-17 моль/л), а также гуманным, т.к. не использует высшие организмы. Способ может использоваться для мониторинга радиотоксичности природных и искусственно полученных радионуклидов и для мониторинга процесса детоксикации растворов радиоактивных элементов.

Формула изобретения

Биолюминесцентный способ мониторинга радиотоксичности раствора, включающий приготовление рабочей и контрольной биолюминесцентных проб, измерение интенсивности биолюминесценции, отличающийся тем, что при приготовлении контрольной пробы используют солевой раствор, а при приготовлении рабочей пробы - солевой раствор, содержащий радионуклиды, пробы инкубируют до 80%-ного ингибирования биолюминесценции контрольной пробы, при этом интенсивность биолюминесценции измеряют на протяжении всего процесса инкубирования, по значениям которой определяют радиотоксичность раствора.

Изобретение "БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ СПОСОБ МОНИТОРИНГА РАДИОТОКСИЧНОСТИ РАСТВОРА" (Кудряшева Надежда Степановна, Кратасюк Валентина Александровна, Рожко Татьяна Владимировна, Болсуновский Александр Яковлевич, Бондарева Лидия Георгиевна) отмечено юбилейной наградой (25 лет Российской Академии Естествознания)
Медаль Альфреда Нобеля

Оформление наградных документов и заказ каталога