СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ЭНДОГЕННОЙ ИНТОКСИКАЦИИ

Название	СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ЭНДОГЕННОЙ ИНТОКСИКАЦИИ
Разработчик (Авторы)	Барканов Вячеслав Борисович, Калашникова Светлана Александровна, Горячев Антон Николаевич
Вид объекта патентного права	Изобретение
Регистрационный номер	2456596
Дата регистрации	01.10.2010
Правообладатель	Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Волгоградский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию"
Область применения (класс МПК)	G01N 33/48 (2006.01) G01N 1/30 (2006.01)

Описание изобретения

Изобретение относится к области медицины, а именно к патологоанатомической и судебно-медицинской практике, и может быть использовано для посмертной морфологической диагностики эндогенной интоксикации.

Сутью эндогенной интоксикации является нарушение работы внутренних органов за счет транслокации бактериального липолисахарида грамотрицательных бактерий из кишечника в системный кровоток. Повреждение печени и почек приводит к недостаточной инактивации и выведению токсинов, что вновь повреждает внутренние органы. Одним из органов, страдающих при эндогенной интоксикации, является кишечник. При эндогенной интоксикации в кишечнике увеличивается проницаемость, и в кровоток, помимо бактериального липополисахарида, проникают продукты гниения ароматических аминокислот - фенол, индол, скатол.

Известен способ морфологической диагностики эндогенной интоксикации, суть которого заключается в морфологической и морфометрической оценке на гистологических препаратах таких показателей, как степень выраженности фиброза, объемная доля ядер, соединительной ткани, относительная площадь, занимаемая клетками и т.д. [Писарев В.Б., Богомолова Н.В., Новочадов В.В., 2008].

Недостатком способа является малая специфичность гепатофиброз, нефросклероз, пневмопатия по отдельности и в совокупности обнаруживаются при других заболеваниях. Также к недостаткам способа относится трудоемкость в морфометрическом подсчете клеточных и тканевых элементов. Еще один недостаток способа - это оценка степени эндогенной интоксикации по конечному результату - изменению органов и тканей, а не по обнаружению токсинов, таких как фенол, индол, скатол.

Известен способ морфологической диагностики эндогенной интоксикации, который заключается в определении биохимических молекул - маркеров интоксикации - веществ средней молекулярной массы, их олигопептидной фракции [Малахова М.Я., 1995].

Недостатком способа является использование в качестве объекта исследования жидких сред организма - крови, мочи, лимфы. Данный способ неприменим для посмертной патологоанатомической и судебно-медицинской диагностики, когда не существует возможности изъять образцы жидких сред организма и диагностические процедуры приходится выполнять на тканевом материале - кусочках внутренних органов.

В качестве прототипа изобретения использован способ качественной гистологической окраски на индол, фенол, скатол, который провидится путем реакции индола, фенола и скатола на гистологических срезах с диазотированными анилиновыми красителями [Лилли Р., 1969].

Недостатком способа является отсутствие количественного измерения индофенолпозитивного продукта на гистологических срезах.

Технической задачей предлагаемого изобретения является повышение точности и специфичности посмертной диагностики эндогенной интоксикации, основанной на непосредственном обнаружении токсических метаболитов, накапливающихся во внутренних органах, а также использование в качестве объекта исследования только кусочков внутренних органов.

Поставленная задача достигается тем, что по способу диагностики эндогенной интоксикации, включающей проведение микроскопического исследования гистологических срезов внутренних органов, перед гистологическим исследованием готовят раствор диазотированного анилинового красителя для окрашивания гистологических срезов для обнаружения индола, фенола, скатола, являющихся маркерами эндогенной интоксикации; окрашивают гистологический срез, проводят микрофотографирование гистологических срезов и компьютерную обработку цифровых микрофотографий гистологических срезов, оценивают среднюю степень окрашивания диазотированным анилиновым красителем в системе цветности RGB и при степени окрашивания от 250 до 100 единиц цветности RGB диагностируют легкую степень эндогенной интоксикации, от 100 до 50 единиц цветности RGB диагностируют среднюю степень эндогенной интоксикации, от 50 до 0 единиц цветности RGB диагностируют тяжелую степень эндогенной интоксикации.

Сущность заявляемого способа. Повышение точности и специфичности диагностики эндогенной интоксикации по заявляемому способу достигается использованием уже известных гистологических окрасок на обнаружение фенола, индола, скатола для верификации их в тканях внутренних органов и оценки с помощью этого способа эндогенной интоксикации. Для этого проводится диазотирование анилиновых красителей нитритом натрия в кислой среде и данный диазотированный краситель вступает в реакцию с индолом, фенолом и скатолом на гистологических срезах, окрашивая их.

Для полуколичественного анализа накопления индола, фенола, скатола можно использовать микрофотографирование гистологических срезов с дальнейшей обработкой цифровых изображений с помощью программных приложений «Adobe Photoshop». Обработка цифровых изображений проводится на микрофотографии, открытой в приложении «Adobe Photoshop 7.0.». Участок ткани, содержащий накопленный субстрат в виде индола, фенола и скатола, окрашивается диазотированным сафранином в синий цвет. На микрофотографии, открытой в приложении «Adobe Photoshop 7.0.», выделяется участок, окрашенный в синий цвет, что соответствует накоплению индола, фенола и скатола. Далее в Меню «Изображение» выбирается опция «Гистограмма» и в системе каналов цвета выбирается «Синий» («Blue»). Итогом вычислений гистограммы служит показатель - средняя величина («Способ»), выдающий ответ в единицах RGB. Измерение данного показателя в двадцати полях зрения в каждой области позволяет рассчитать среднее значение яркости в каждой исследуемой области и стандартное отклонение яркости

Наши исследования показали, что в норме индол, фенол и скатол отсутствуют в тканях внутренних органов. При степени окрашивания от 250 до 100 единиц цветности RGB диагностируется легкая степень эндогенной интоксикации, от 100 до 50 единиц цветности RGB диагностируется средняя степень эндогенной интоксикации, от 50 до 0 единиц цветности RGB диагностируется тяжелая степень эндогенной интоксикации.

Таким образом, предлагаемое решение задачи содержит новые признаки (использование уже существующей гистологической окраски для нового способа количественной диагностики патологического процесса) и имеет изобретательский уровень. Отличительные признаки необходимы и достаточны для достижения поставленной задачи. Исходя из вышеизложенного заявляемое техническое решение в целом отвечает критериям изобретения.

Методика заявляемого способа диагностики эндогенной интоксикации включает проведение микроскопического исследования гистологических срезов внутренних органов, перед гистологическим исследованием готовят раствор диазотированного анилинового красителя для окрашивания гистологических срезов для обнаружения индола, фенола, скатола, являющихся маркерами эндогенной интоксикации; окрашивают гистологический срез, проводят микрофотографирование гистологических срезов и компьютерную обработку цифровых микрофотографий гистологических срезов, оценивают среднюю степень окрашивания диазотированным анилиновым красителем в системе цветности RGB и при степени окрашивания от 250 до 100 единиц цветности RGB диагностируют легкую степень эндогенной интоксикации, от 100 до 50 единиц цветности RGB диагностируют среднюю степень эндогенной интоксикации, от 50 до 0 единиц цветности RGB диагностируют тяжелую степень эндогенной интоксикации.

Пример конкретного выполнения. Нами было проведено экспериментальное исследование, целью которого было установление зависимости между степенью тяжести эндогенной интоксикации и интенсивностью окраски тканей внутренних органов диазотированными красителями на индол, фенол, скатол.

Работа была выполнена на 45 нелинейных белых крысах обоего пола массой 180-210 г. Выбор, содержание животных, моделирование патологических процессов и выведение крыс из опыта осуществляли на основе базисных нормативных документов МЗ РФ и рекомендаций ВОЗ.

При моделировании эндогенной интокскации у 25-ти животных была использована классическая модель с преимущественным поражением печени, основанная на комбинированном введении малых доз бактериального липополисахарида и тетрахлорметана в течение 30-ти суток [Писарев В.Б., Богомолова Н.В. Новочадов В.В., 2008].

20 интактных животных выступали в качестве контрольной группы.

Животных выводили из эксперимента передозировкой нембутала.

Выраженность эндогенной интоксикации верифицировали по следующим биохимическим показателям: содержанию в плазме крови веществ средней молекулярной массы (ВСММ) и их олигопептидных фракций, концентрации малонового диальдегида (МДА).

В качестве органа для исследования степени накопления диазотированных фенола, индола, скатола нами была выбрана печень. Выбор обусловлен тем, что при эндогенной интокскации продукты гниения аминокислот поступают из кишечника в портальный кровоток. Таким образом, печень - это первый орган на пути кишечных токсинов.

С образцов тканей печени были получены гистологические срезы, которые окрашивали по общепринятой методике: гематоксилином и эозином по общепринятой методике. Для выявления соединительной ткани использовали окраску по ван Гизон.

Для окраски печени на индол, фенол, скатол проводилось диазотирование анилиновых красителей (в нашем случае мы использовали сафранин) с последующим диазосочетанием с индофенольными веществами в ткани печени уже на гистологических срезах.

Диазотирование проводилось следующим способом. Использовали реактивы: сафранин, 1н. соляная кислота, нитрит натрия, п-диметиламинобензальдегид, концентрированная соляная кислота.

Готовится раствор А. - растворяют 1 ммоль сафранина (351 мг) в смеси 3 мл 1н. соляной кислоты и добавляют 6 мл дистиллированной воды. Охлаждают до 3°C. Перед окрашиванием к 9 мл этой смеси добавляют 1 мл 1М охлажденного раствора нитрита натрия.

Готовится раствор В. 1 г п-диметиламинобензальдегида, 10 мл концентрированной соляной кислоты, 30 мл ледяной уксусной кислоты.

Протокол окрашивания.

1. Срезы погружают в ксилол, далее в спирт.

2. Быстро высушивают и погружают в раствор В - 5 мин, 25°С.

3. Промывают в 3-х сменах ледяной уксусной кислоты (30, 60, 60 сек).

4 Добавляют 1 мл раствора А к 40 мл холодной ледяной уксусной кислоты, перемешивают и заливают смесью срезы в охлажденном сосуде - 5 мин.

5. Промывают в 2-х сменах ледяной уксусной кислоты.

6. Проводят через 3-4 смены ксилола.

7. Заключают срезы в бальзам под покровное стекло.

Полученные гистологические препараты фотографировали насадкой - фотонасадкой DCM 130 к микроскопу Микмед-6 (ЛОМО, Россия).

Цифровые изображения обрабатывали программным пакетом «Adobe Photoshop» для построения гистограмм распределения красителя путем оценки яркости окраски в системе цветности RGB.

Математическая обработка проводилась непосредственно из общей матрицы данных EXCEL 7.0 (Microsoft, USA) с привлечением возможностей программ STATGRAPH 5.1 (Microsoft, USA) и включала определение показателей средней, ее среднеквадратичного отклонения и ошибки репрезентативности.

При моделировании эндогенной интокскации концентрации ВСММ и их олигопептидные фракции регистрировались на уровне, превышающем аналогичные показатели в контрольной группе в 2,69 раза (Р<0,05) и в 2,32 раза (Р<0,05), соответственно (табл.1).

Аналогичное увеличение в плазме крови было обнаружено и для МДА.

Исходя из полученных данных можно говорить о том, что по биохимическим данным в опытной группе верифицировалось развитие эндогенной интоксикации.

При исследовании тканей печени в группе с эндогенной интокскацией развивались изменения по типу хронического токсического поражения печени с развитием, в конечном итоге, гепатофиброза. Наблюдался умеренно выраженный склероз перипортальных трактов, лимфогистиоцитарная инфильтрация новообразованной соединительной ткани.

Гепатоциты, расположенные центролобулярно, были в состоянии вакуольной дистрофии, единичные из них - с явлениями кариопикноза и кариолизиза ядер. Печеночные клетки по периферии дольки повреждались в меньшей степени. Наряду с этим отмечено поражение малых вен и венул в виде разрастания волокнистой соединительной ткани стенок, пролиферации эндотелия с явлениями капилляризации синусоидов. Стенка сосудов и пространства Диссе находились в состоянии умеренного отека.

Таким образом, морфологическое исследование также подтвердило развитие эндогенной интоксикации в опытной группе животных.

При окрашивании тканей печени в контрольной группе незначительное накопление индофенолпозитивного субстрата наблюдалось в перипортальных областях печени, не затрагивая другие зоны печеночных долек. Такая локализация понятна, учитывая, что индол, фенол, скатол и в норме в микроколичествах проникают через кишечник в портальный кровоток и адсорбируются теми клетками, которые находятся ближе всего к портальной триаде.

В опытной группе с эндогенной интоксикацией накопление диазотированных индофенолов происходило на всем протяжении печеночной дольки - от портальной триады до центральной вены. Этому тоже можно найти объяснение - после того, как метаболические ресурсы всех клеток печени исчерпаны и они более не способны инактивировать индофенолы, последние накапливаются в цитоплазме клеток, не метаболизируясь. Избыток идет в системный кровоток, повреждая органы.

Морфометрическое исследование тканей печени в диазоокраске показало, что в группе сравнения максимальное накопления субстрата соответствовало 230,6±10,9 единиц цветности RGB. В опытной группе этот показатель находился в пределах 78,4±6,3 единиц цветности RGB.

Исходя из результатов исследования можно говорить о том, что при эндогенной интоксикации происходит статистически достоверное увеличение количества индола, фенола, скатола в цитоплазме клеток печени, что может служить диагностическим критерием для посмертной морфологической диагностики эндогенной интоксикации.

Преимущество и положительный эффект заявляемого способа.

Использование гистологической окраски диазотированными анилиновыми красителями тканей внутренних органов в заявленном способе значительно облегчало выявление индола, фенола, скатола. В целом это повышало точность посмертной диагностики эндогенной интоксикации. Наши показатели являются унифицированными количественными параметрами, которые являются объективными критериями диагностики эндогенной интоксикации.

Источники информации, принятые во внимание при оформлении заявленного изобретения

1. Писарев В.Б., Богомолова Н.В., Новочадов В.В. Бактериальный эндотоксикоз: взгляд патолога. - Волгоград. - Изд-во ВолГМУ. - 2008. - 310 с.

2. Малахова М.Я. Метод оценки эндогенной интокскации. - СПб. - 1995. - 72 с.

3. Лилли Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия. - М.: - Изд-во «Мир». - 1969. - 648 с.

Формула изобретения

Способ диагностики эндогенной интоксикации, включающий проведение микроскопического исследования гистологических срезов внутренних органов, отличающийся тем, что перед гистологическим исследованием готовят раствор диазотированного анилинового красителя для окрашивания гистологических срезов для обнаружения индола, фенола, скатола, являющихся маркерами эндогенной интоксикации, окрашивают гистологический срез, проводят микрофотографирование гистологических срезов и компьютерную обработку цифровых микрофотографий гистологических срезов, оценивают среднюю степень окрашивания диазотированным анилиновым красителем в системе цветности RGB и при степени окрашивания от 250 до 100 единиц цветности RGB диагностируют легкую степень эндогенной интоксикации, от 100 до 50 единиц цветности RGB диагностируют среднюю степень эндогенной интоксикации, от 50 до 0 единиц цветности RGB диагностируют тяжелую степень эндогенной интоксикации.

Изобретение "СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ЭНДОГЕННОЙ ИНТОКСИКАЦИИ" (Барканов Вячеслав Борисович, Калашникова Светлана Александровна, Горячев Антон Николаевич ) отмечено юбилейной наградой (25 лет Российской Академии Естествознания)
Медаль Альфреда Нобеля

Оформление наградных документов и заказ каталога