Способ профилактики нодулярного дерматита КРС

Название	Способ профилактики нодулярного дерматита КРС
Разработчик (Авторы)	Черных Олег Юрьевич, Баннов Василий Александрович, Мищенко Алексей Владимирович, Шевкопляс Владимир Николаевич, Кривонос Роман Анатольевич, Кощаев Андрей Георгиевич, Джаилиди Георгий Анастасович, Лысенко Юрий Андреевич, Лысенко Александр Анатолиевич, Дресвянникова Светлана Георгиевна, Чернов Альберт Николаевич, Шевченко Александр Алексеевич, Федоренко Карина Петровна
Вид объекта патентного права	Изобретение
Регистрационный номер	2619337
Дата регистрации	11.08.2016
Правообладатель	Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет"
Область применения (класс МПК)	G01N 33/50 (2006.01) C12Q 1/68 (2006.01) A61L 9/015 (2006.01)

Описание изобретения

Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к способу профилактики нодулярного дерматита крупного рогатого скота.

Известен способ санации животноводческих помещений в присутствии животных, в котором осуществляют обработку животноводческих помещений озоновоздушной смесью, отличающийся тем, что обработку осуществляют озоновоздушной смесью с концентрацией озона 1-3 мг/м³ с периодичностью 24 часа в течение 1,5-2 часа, которую готовят с помощью озонатора, установленного непосредственно в животноводческом помещении (RU №2542504).

Недостатком данного способа является невозможность его использования для проведения дезинфекции помещений в присутствии животных в случае их заражения вирусом африканской чумы свиней, т.к. для уничтожения данной инфекции необходима обработка озоно-воздушной смесью с более высокой концентрацией озона.

Известен способ оздоровления хозяйств от лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС), включающий оздоровительные мероприятия, которые проводят по вариантам в зависимости от первоначальной инфицированности стада, определенной по результатам серологического исследования, изоляцию инфицированных ВЛКРС животных и немедленную сдачу на убой больных животных, отличающийся тем, что при первоначальной инфицированности стада до 2,5% инфицированных животных немедленно сдают на убой, а остальных животных исследуют каждые 3 месяца с обязательным удалением инфицированных животных; в хозяйствах, где выявлено 2,6-10,0% животных, инфицированных ВЛКРС, инфицированных животных собирают на отдельной ферме, откуда молодняк после откорма коров после отела и по мере прекращения лактации сдают на убой, оставшихся животных исследуют серологическим методом на ВЛКРС и вновь выявленных инфицированных животных немедленно переводят на указанную ферму; при первоначальной инфицированности стада 10,1-40,0% всех животных в хозяйстве делят на две группы: серопозитивные и серонегативные и содержат их изолированно друг от друга, инфицированных животных каждые 6 месяцев исследуют гематологическим методом и признанных больными сдают на убой, а коров и нетелей, не инфицированных ВЛКРС, исследуют серологическим методом с интервалом три месяца, при этом вновь выявленных серопозитивных животных переводят в группу инфицированных коров; при первоначальной инфицированности стада более 40,0% всех взрослых животных исследуют только гематологическим методом через каждые 6 месяцев и выявленных больных сдают на убой (RU №2268589).

Недостатком данного способа является продолжительность диагностирования лейкоза крупного рогатого скота серологическим методом, что в свою очередь способствует прогрессивному развитию заболевания, ведущему к массовой гибели животных.

Техническим результатом является расширение функциональных возможностей способа профилактики нодулярного дерматита крупного рогатого скота.

Технический результат достигается тем, что в способе профилактики нодулярного дерматита крупного рогатого скота, включающем выявление 2,5-3% от общего количества животных с инфекционным заболеванием на начальной стадии развития в очаге и 1-й угрожаемой зоне, убой больных и дальнейшее обследование остальных животных, согласно изобретению остальных животных в очаге инфекционного заболевания нодулярного дерматита крупного рогатого скота обследуют в течение суток методом экспресс-диагностики, включающим отбор проб крови животных, выделение из нее ДНК генома вирусного заболевания, проведение полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени, по результатам которой выявляют животных-носителей вируса и здоровых животных, которых переводят в отдельные помещения и в их присутствии осуществляют санацию помещений озоно-воздушной смесью: в помещении с животными-носителями вируса - в течение месяца не менее 3-4 раз в неделю с концентрацией озона 4-6 г/м³ в течение 20-30 минут, в помещении со здоровыми животными - в течение не более двух недель 2-3 раза в неделю с концентрацией озона 3-4 г/м³ в течение 15-20 минут.

Новизна заявляемого способа профилактики нодулярного дерматита крупного рогатого скота состоит в идентификации вируса в пробах патологического материала с помощью полимеразной цепной реакции (ГТЦР) с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени в течение суток, что в свою очередь позволяет выявить животных-носителей вируса нодулярного дерматита крупного рогатого скота на начальной стадии их инфицирования, а также осуществлении санации помещений, в которых отдельно друг от друга присутствуют животные-носители вируса и здоровые животные.

Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, направлены на достижение технического результата и не выявлены при изучении данной и смежной областей науки и техники и, следовательно, соответствуют критерию «изобретательский уровень».

Эти отличия позволяют сделать вывод о соответствии заявляемых технических решений критерию «новизна».

Заявляемый способ профилактики нодулярного дерматита крупного рогатого скота рекомендовано использовать в специализированных ветеринарных, животноводческих, сельскохозяйственных предприятиях.

Способ профилактики нодулярного дерматита крупного рогатого скота осуществляют следующим образом.

В стаде крупного рогатого скота ведут забор проб крови от каждого животного. Цельная кровь (во время виримия) забирается в пробирку с 6% ЭДТА из расчета 50 мкл раствора ЭДТА на 1 мл крови, закрытую пробирку с кровью несколько раз переворачивают. Для получения сыворотки забирают кровь в пробирку без антикоагулянта. Помимо крови, в качестве исследуемого материала также используют фрагменты тканей и органов (нодулы, селезенка, лимфатические узлы). Для подготовки пробы к проведению полимеразной цепной реакции используют различные методики, с помощью которых осуществляют экстракцию ДНК из полученных образцов сыворотки крови животных и удаление или нейтрализацию посторонних примесей для получения препарата ДНК с чистотой, пригодной для проведения полимеразной цепной реакции.

Для подготовки образцов и проведения полимеразной цепной реакции используют специальный набор реагентов для выявления возбудителя нодулярного дерматита крупного рогатого скота «ПЦР-НОДУЛЯРНЫЙ ДЕРМАТИТ КРС-ФАКТОР», состоящий из двух комплектов (таблица 1 и 2):

При подготовке образцов в отдельной пробирке смешивают компоненты набора из расчета на каждую реакцию: 10 мкл ПЦР СМЕСЬ LSDV, 5 мкл смеси ПЦР БУФЕР LSDV, 0,5 мкл TAQ POLYMERASE, данную смесь перемешивают и сбрасывают капли кратковременным центрифугированием. Затем отбирают необходимое количество пробирок для амплификации ДНК исследуемых и контрольных проб, вносят по 15 мкл приготовленной реакционной смеси. Используя наконечники с фильтром, в подготовленные пробирки добавляют:

1) отрицательный контроль ПЦР (К-) - вносят в пробирку по 10 мкл отрицательного контрольного образца;

2) по 10 мкл ДНК из исследуемых образцов (включая ОКО) в соответствующие пробирки;

3) положительный контроль ПЦР (К+) - вносят в пробирку 10 мкл положительного контрольного образца LSDV.

Далее осуществляют полимеразную цепную реакцию с флуоресцентным детектором в режиме реального времени на амплификаторе Rotor-Gene 3000/6000. Прибор программируют, устанавливают параметры температурно-временного режима амплификации, детекцию флуоресцентного сигнала назначают после стации отжига праймеров, после чего начинают процесс амплификации с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени. В его основе лежит принцип флуоресцентной детекции продуктов полимеразной цепной реакции непосредственно в ходе амплификации. Детекция продуктов амплификации проводится прямо в реакционной среде через стенки или крышку закрытой пробирки.

ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени имеет ряд значительных преимуществ:

- объединение этапов амплификации и детекции результатов. Появляется возможность оценить кинетику процесса, которая зависит от начального количества исследуемого материала;

-существенное снижение риска контаминации и ошибок при анализе результатов;

- высокая специфичность реакции за счет использования высокоспецифичных флуоресцентных зондов;

- высокая производительность;

- упрощение требований к организации ПЦР-лаборатории;

- возможность количественной оценки исходной ДНК матрицы;

- регистрация и учет данных в электронном формате.

ПЦР в реальном времени характеризуется возможностью проведения качественного и количественного анализа. Регистрируемое в процессе амплификации нарастание сигнала от отделенного флуорофора прямо пропорционально увеличению концентрации синтезированных специфических продуктов и отражает концентрацию ДНК в исходной матрице.

Учет результатов полимеразной цепной реакции, согласно указанной выше инструкции, проводят по наличию или отсутствию пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией. Образец считают положительным (вирус нодулярного дерматита крупного рогатого скота присутствует), если наблюдают рост специфического сигнала, при этом значения контрольных образцов находятся в пределах нормы. Образец считают отрицательным (вирус нодулярного дерматита крупного рогатого скота отсутствует), если не наблюдают рост специфического сигнала, при этом значения контрольных образцов находятся в пределах нормы.

В результате проведения полимеразной цепной реакции с флуоресцентным детектором в режиме реального времени при выявлении первоначального инфицирования вирусом нодулярного дерматита крупного рогатого скота 2,5-3% голов животных от общего количества в стаде, инфицированных особей сдают на убой, после чего животных-носителей инфекции и здоровых особей переводят в отдельные помещения. Затем осуществляют санацию помещений в присутствии животных с помощью озоно-воздушной смеси, при этом в помещении с животными-носителями вируса ее проводят в течение месяца 3 раза в неделю с концентрацией озона 5 мг/м³ в течение 25 минут. В помещении со здоровыми животными санацию проводят в течение двух недель 2 раза в неделю с концентрацией озона 4 мг/м³ в течение 18 минут.

Результаты проведения опытов по санации помещений показывают, что санация помещения озоно-воздушной смесью с концентрацией озона 1-3 мг/м³ является малоэффективной при содержании общего микробного числа по результатам анализа санитарно-микробиологического контроля воздуха в животноводческом помещении более 200 тыс./м³, уровнем аммиака более 20 мг/м³ и сероводорода более 15 мг/м³, т.к. незначительно повлияла на снижение указанных показателей.

После санации помещений озоно-воздушной смесью с концентрацией озона 7-10 мг/м³ наблюдалось значительное снижение параметров ОМЧ, аммиака и сероводорода в воздухе, однако последствием такой дезинфекции являлось ухудшение общего самочувствия животных, снижение их активности и аппетита. Поэтому по итогам проведенных испытаний наиболее оптимальной признана санация с концентрациями озона 4 и 5 мг/м³, т.к. санация озоно-воздушной смесью с данными концентрациями озона не оказывала токсикологического побочного эффекта, а также снижала уровень содержания вредных веществ в животноводческих помещениях до регламентированных норм. Данные по содержанию вредных соединений в воздухе животноводческих помещений до и после санации в зависимости от концентрации озона в озоно-воздушной смеси представлены в таблицах 1 и 2.

По итогам санации видно, что обработка помещений озоно-воздушной смесью с концентрацией озона 4-5 мг/м³ в течение 15-25 минут снижает уровень загрязнения воздуха вредными соединениями до предельно допустимых значений, при этом не оказывая вредного токсикологического воздействия на состояние здоровья животных.

Результаты проведенных мероприятий в животноводческих помещениях в присутствии животных позволяют сделать вывод о том, что данный способ нодулярного дерматита крупного рогатого скота эффективен в качестве улучшения и сохранения санитарного состояния на животноводческих предприятиях.

Формула изобретения

Способ профилактики нодулярного дерматита КРС, включающий выявление 2,5-3% от общего количества животных с инфекционным заболеванием на начальной стадии развития в очаге и 1-й угрожаемой зоне, убой больных и дальнейшее обследование остальных животных, отличающийся тем, что остальных животных в очаге инфекционного заболевания нодулярного дерматита крупного рогатого скота обследуют в течение суток методом экспресс-диагностики, включающим отбор проб крови животных, выделение из нее ДНК генома вирусного заболевания, проведение полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени, по результатам которой выявляют животных-носителей вируса и здоровых животных, которых переводят в отдельные помещения и в их присутствии осуществляют санацию помещений озоно-воздушной смесью: в помещении с животными-носителями вируса - в течение месяца не менее 3-4 раз в неделю с концентрацией озона 4-6 г/м³ в течение 20-30 минут, в помещении со здоровыми животными - в течение не более двух недель 2-3 раза в неделю с концентрацией озона 3-4 г/м³ в течение 15-20 минут.

Изобретение "Способ профилактики нодулярного дерматита КРС" (Черных Олег Юрьевич, Баннов Василий Александрович, Мищенко Алексей Владимирович, Шевкопляс Владимир Николаевич, Кривонос Роман Анатольевич, Кощаев Андрей Георгиевич, Джаилиди Георгий Анастасович, Лысенко Юрий Андреевич, Лысенко Александр Анатолиевич, Дресвянникова Светлана Георгиевна, Чернов Альберт Николаевич, Шевченко Александр Алексеевич, Федоренко Карина Петровна ) отмечено юбилейной наградой (25 лет Российской Академии Естествознания)
Медаль Альфреда Нобеля

Оформление наградных документов и заказ каталога