Производные 5-этил-2-амино-1, 3, 4-тиадиазола, обладающие обезболивающей, противовоспалительной, противоаллергической и анальгетической активностями

Название	Производные 5-этил-2-амино-1, 3, 4-тиадиазола, обладающие обезболивающей, противовоспалительной, противоаллергической и анальгетической активностями
Разработчик (Авторы)	Скачилова София Яковлевна, Желтухин Николай Константинович, Демидова Марина Александровна, Попов Никита Сергеевич, Казаишвили Юрий Георгиевич, Коротоножкин Алексей Викторович, Проскурина Оксана Владимировна, Ольхович Марина Васильевна, Перлович Герман Леонидович
Вид объекта патентного права	Изобретение
Регистрационный номер	2651572
Дата регистрации	23.04.2018
Правообладатель	Открытое акционерное общество "Всероссийский научный центр по безопасности биологически активных веществ" (ОАО "ВНЦ БАВ")
Область применения (класс МПК)	C07D 285/135 (2006.01) A61K 31/433 (2006.01) A61P 29/00 (2006.01)

Описание изобретения

Область применения

Изобретение относится к области медицины, конкретно к химическим соединениям, а именно к новым производным 5-Этил-2-амино-1,3,4-тиадиазола, обладающим обезболивающей, противовоспалительной, противоаллергической и анальгетической активностями.

N-(5-этил-1,3,4-тиадиазол-2-ил)-амид N-ацетиламиногексановой кислоты,

Соединение 1

5-Этил-2-амино-1,3,4-тиадиазола сукцинат, Соединение 2

5-Этил-2-амино-1,3,4-тиадиазола D,L-гидроксисукцинат,

Соединение 3

Уровень техники

Одной из перспективных групп для поиска новых обезболивающих средств являются производные 1,3,4-тиадиазола. Производные тиадиазола по химической структуре имеют сходство с пиримидином и оксадиазолом. Атом серы тиадиазола придает этим соединениям липофильные свойства, что обеспечивает их проницаемость через биологические мембраны. Вместе с тем известно, что вещества, имеющие в своей структуре пятичленные гетероциклы, в том числе цикл тиадиазола, обладают широким спектром биологической активности. Среди производных тиадиазола известны соединения с бронхолитической, противовоспалительной, обезболивающей, антиоксидантной, противовирусной, антибактериальной, гепатопротекторной, антипролиферативной, нейропротекторной и другими видами активности. Преимуществом известных производных тиадиазола является большая широта терапевтического действия (Yijing Li et al., 2012).

Вышесказанное стимулирует поиск новых химических соединений с высокой противовоспалительной, антиаллергической и анальгезирующей активностями и относительной безопасностью применения среди новых производных тиадиазола.

Близким аналогом заявляемых соединений является известное вещество из класса тиадиазолов - N-(5-этил-1,3,4,- тиадиазол-2-ил)-4-нитробензамид (патент РФ №2448961), обладающее противовоспалительной, бронхолитической, противотуберкулезной активностями. Однако противовоспалительная активность этого соединения изучена только на модели сефадекс индуцированного бронхоальвеолита.

Известные противовоспалительные нестероидные лекарственные средства (НПВС), широко применяемые в медицинской практике, имеют ряд нежелательных побочных реакций: ульцерогенность, эрозивно-язвенные поражения желудочно-кишечного тракта с кровотечениями, выраженные изменения функции печени, почек и другие. Широко применяемые в медицине противовоспалительные, антиаллергические глюкокортикостероиды также обладают нежелательными побочными реакциями: отрицательное влияние на систему надпочечников, повышение АД, сниженте плотности костей и другие. (Машковский М.Д., Лекарственные средства, М. «Новая волна», 2013, с. 168-179, 561-562).

В доступной литературе заявляемые производные тиадиазола не описаны.

Раскрытие изобретения

Целью настоящего изобретения являются новые биологически активные производные 5-этил-2-амино-1,3,4-тиадиазола.

Поставленная цель достигается созданием новых производных тиадиазола и исследованием их биологической активности.

Предлагаемые новые производные 5-этил-1,3,4-тиадиазола обладают противовоспалительными свойствами, сопоставимыми с нестероидными противовоспалительными средствами НПВС, обезболивающей, противовоспалительной, противоаллергической и анальгетической активностями. В отличие от (НПВС) новые производные 5-этил-2-амино-1,3,4-тиадиазола практически не обладают ульцерогенностью.

Указанные свойства позволяют предполагать возможность применения предлагаемых новых соединений в качестве потенциальных противовоспалительных, антиаллергических лекарственных средств для лечения различных бронхолегочных заболеваний, воспалительных заболеваний опорнодвигательной системы, послеоперационных болей, ревматоидных, артритов, артрозов, васкулитов и других.

Заявляемые соединения могут быть использованы для создания лекарственных препаратов.

1. Синтез производных 5-этил-2-амино-1,3,4-тиадиазола (1,2,3)

Нами синтезированы новые производные тиадиазола, 5-этил-2-амино-1,3,4-тиадиазола, и исследована их биологическая активность.

Пример 1. N-(5-этил-1,3,4-тиадиазол-2-ил)-амид N-ацетиламиногексановой кислоты, соединение 1

В трехгорлую колбу, снабженную мешалкой, термометром и холодильником, загружают 100 мл ацетонитрила, 12,91 г (0,1 м) 2-амино-5-этил-1,3,4-тиадиазола, массу перемешивают, постепенно добавляют16,65 г (0,1 м) хлорангидрида N-ацетиламиногексановой кислоты, нагревают до кипения, через 3 часа отгоняют ацетонитрил, прибавляют 150 мл дистиллированной воды, тщательно перемешивают, нагревают до 80°С, через 15-20 минут осадок отфильтровывают, промывают на фильтре дистиллированной водой до рН 6-7 промывной воды, сушат до постоянного веса при 100-105°С.

Получают 26,48 г соединения 1.

Белый кристаллический порошок Т_пл 208-210°С

Найдено, %: С 50,91; Н 7,23; N 19.56: S 11,23

C₁₂H₂₀N₄0₂S, Мм 284,34

Вычислено, %: С 50,70; Н 7,04; N 19.72: S 11,87

ИК-спектр, ∨см^-1: 3380 (NH), 1782 (-N=C), 1540,1560 (СО NH амид)

УФ-спектр: 0,001% раствор в 0,01 м растворе натрия гидроксида имеет максимум при 257±2 нм.

Пример 2. N-(5-этил-1,3,4-тиадиазол-2-ил)-амид N-ацетиламиногексановой кислоты, соединение 1

Аналогично примеру 1 загружают 6.46 г (0,05 м) 2-амино-5-этил-1,3,4-тиадиазола, приливают 80 мл хлористого метилена и 18 мл пиридина. Массу перемешивают, постепенно добавляют 8,58 г (0,05 м) хлорангидрида N-ацетиламиногексановой кислоты, перемешивают при кипении 5-6 часов, отгоняют хлористый метилен, прибавляют 100 мл дистиллированной воды, нагревают при перемешивании до 80°С через 15-20 минут осадок отделяют, промывают на фильтре дистиллированной водой до рН 6-7 промывной воды, сушат до постоянного веса при 208-210°С.

Получают 12,95 г соединения 1 с выходом 93,5%. Т_пл. 208-210°С.

ИК-спектр, ∨см^-1: 3380 (NH), 1782 (-N=C), 1540,1560 (СО NH амид)

УФ-спектр: 0,001% раствор в 0,01 м растворе натрия гидроксида имеет максимум при 257±2 нм.

Пример 3. 2-амино-5-этил-1,3,4-тиадиазола бутандиоат (сукцинат), соединение 2

К 100 мл этилового спирта добавляют 12,91 г (0,1 м) 2-амино-5-этил-1,3,4-тиадиазола, 11.81 г (0,1 м) бутандиовой (янтарной) кислоты. Реакционную массу перемешивают и нагревают с обратным холодильником до 70-75°С, выдерживают в течение 30-40 минут. Растворитель отгоняют, осадок перекристаллизовывают из пропанола-2.

Получают 23,04 г, соединение 2, белые с желтоватым оттенком кристаллы, Т_пл. 164-166°С.

Найдено %: С 38,83; Н 5,31; N 16,97: S 12,98

C₈H₁₃N₃0₄S, Мм 247,21

Вычислено %: С 38,87; Н 5,26; N 17,00: S 12,96

ИК-спектр, ∨см^-1: 3346 (NH), 1780 (-N=C), 1540,1550 (СО NH амид)

УФ-спектр: 0,001% раствор в 0,1 м растворе кислоты хлористоводородной имеет максимум при 267±2 нм.

Пример 4. 2-амино-5-этил-1,3,4-тиадиазола гидроксибутандиоат (гидроксисукцинат), соединение 3

К 150 мл пропанола-2 добавляют 12,91 г (0,1 м) 2-амино-5-этил-1,3,4-тиадиазола, 13,42 г(0,1 м) гидроксибутандиовой кислоты. Реакционную массу перемешивают и нагревают до 75-80°С, выдерживают 1,0-1,5 часа. Растворитель отгоняют, осадок перекристаллизовывают из пропанола-2.

Получают 24,96 г соединения 3, белый с желтоватым оттенком кристаллический порошок, Т_пл 134-136°С.

Найдено %: С 36,47; Н 5,09; N 15,91: S 12,11

C₈H₁₃N₃0₅S, Мм 263,29

Вычислено %: С 36,50; Н 4,94; N 15,99: S 12,17

ИК-спектр, ∨см^-1: 3450 (ОН); 3348 (NH), 1782 (-N=C), 1565, (СОО-)

УФ-спектр: 0,001% раствор в 0,1 м растворе кислоты хлористоводородной имеет максимум при 267±2 нм.

2. Исследования биологической активности соединений 1, 2, 3

Экспериментальные исследования выполнены на 150 мышах (белых неинбредных) обоего пола массой 20,1±0,9 г и 170 белых неинбредных крысах обоего пола массой 234,4±4,9 г и на нелинейных мышах-самках (n=24), в соответствии с рекомендациями МЗРФ (Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. М. 2012)

Соединения 1, 2, 3 использовали в виде субстанций, вводили животным либо в виде растворов, применяя в качестве растворителя физиологический раствор натрия хлорида, либо в виде суспензии в полисорбате 80 (твин 80) или с 1% крахмалом (в случае внутрижелудочного введения).

В качестве препаратов сравнения использовали известные лекарственные препараты: диклофенак натрия ииндометацин, кетопрофен, а также глюкокортикостероиды, преднизалон. Животные контрольной группы получали физиологический раствор.

2.1. Оценка острой токсичности

Оценку острой токсичности новых производных тиадиазола осуществляли в диапазоне доз 320 мг/кг - 5120 мг/кг при внутрибрюшинном введении мышам, определяя значение LD₅₀ по значению средних эффективных доз (В.Б. Прозоровский, 2007).

Результаты эксперимента показали, что значение LD₅₀ при внутрибрюшинном введении мышам для соединения 1 - 834±81 мг/кг и 860,99 мг/кг для соединения 2 и 940,31 мг/кг для соединения 3.

Полученные данные позволили отнести соединения 1, 2, и 3 к малотоксичным веществам (3 класс токсичности) в соответствии с ГОСТом 12.1.007-76.

2.2. Оценка обезболивающей активности

2.2.1. Тест горячей пластины

Оценку обезболивающей активности новых производных тиадиазола проводили в экспериментах на белых неинбредных мышах с использованием теста горячей пластины. Было обнаружено, что при помещении подопытных животных на горячую пластину температурой 55°С порог болевой чувствительности (время до появления оборонительного рефлекса) составил 14,5±0,2 с.

Данные опытов с внутрибрюшинным введением диклофенака натрия (50 мг/кг) и соединения 2 приведены в таблице 1.

Обезболивающая активность в тесте горячей пластины при внутрибрюшинном введении мышам соединения 2 (48,9 мг/кг) и соединения 3 (45,3 мг/кг) отмечена на уровне диклофенака натрия (50 мг/кг).

2.2.2. Тест на модели химического раздражения

Данные приведены в таблице 2

Обезболивающая активность соединения 2 и соединения 3 при внутрибрюшинном введении в дозе 5% LD₅₀ при термическом раздражении у мышей в тесте горячей пластины и при химическом раздражении брюшины у крыс была соответственно на уровне диклофенака натрия и кетопрофена.

2.3. Оценка противовоспалительной активности

Противовоспалительную активность новых соединений оценивали на модели формалинового отека лапы у крыс. Было выявлено, что при субплантарном введении 0,1 мл 2% раствора формалина у подопытных крыс развивается выраженный отек лапы, о чем свидетельствует достоверное увеличение ее объема. Отмечено, что максимальный отек лапы (пик воспаления) развивался через 2 часа после введения формалина, при этом объем лапы у подопытных животных контрольной группы (физиологический раствор) увеличивался в среднем на 26,5% (р<0,05). Следует отметить, что и через 24 часа после введения формалина объем лапы у подопытных животных контрольной группы был в среднем на 13,5% больше, чем до введения флогогенного фактора (табл. 3).

В опытах с использованием кетопрофена (23 мг/кг) выраженность формалин-индуцированного отека лапы крыс была в среднем на 14% меньше, чем в контроле.

Эффективность соединений 1 и 2 была на уровне препарата сравнения кетопрофена или превосходила его.

Сопоставимые результаты были получены и в отношении торможения пролиферативной фазы воспаления. Так, у подопытных крыс, получавших ежедневно внутрижелудочно соединение 1 в дозе 21,5 мг/кг (0,05 DL₅₀), пролиферативная реакция составила (р<0,05) 4,5 мг, что в среднем (р<0,05) в 5,98 раз меньше, чем в контроле. Торможение пролиферативной фазы воспаления при этом составило в среднем (р<0,05) 83,3%.

Пролиферативная реакция у крыс, получавших ежедневно внутрижелудочно кетопрофен в дозе 23 мг/кг (0,05 DL₅₀), составила (р<0,05) 9,4 мг, что в среднем (р<0,05) в 2,86 раз меньше, чем в контроле.

Торможение пролиферативной фазы воспаления под влиянием соединения 1 составило (р<0,05) 83,3%, что в 1,28 раза меньше, чем при использовании кетопрофена (табл. 4).

2.4. Оценка анальгетической активности

Оценку анальгетической активности соединений 2 и 3 осуществляли на модели гипертермической реакции у крыс, вызванной введением пирогенала.

В серии опытов с введением кетопрофена (23 мг/кг) достоверного повышения температуры тела у подопытных животных после введения пирогенала отмечено не было. Было выявлено, что соединение 2 при пероральном применении до введения пирогенного фактора также предупреждало повышение температуры тела у подопытных крыс. Выраженность жаропонижающей активности исследуемых соединений соответствовала эффектам кетопрофена (табл. 5).

2.5. Оценка противоаллергической активности

Анализ результатов экспериментов по оценке противоаллергической активности показал, что соединение 2 обладает способностью уменьшать выраженность реакции активной кожной анафилаксии у мышей. Было выявлено, что у подопытных мышей, сенсибилизированных овальбумином, при внутрикожном введении антигена (овальбумина) на 21-й день латентного периода сенсибилизации развивалась местная аллергическая реакция. Визуально кожная анафилаксия проявлялась окрашиванием участка кожи в синий цвет, что было связано с выходом красителя (Эванса синего) из кровеносного русла в очаг аллергического поражения (в месте внутрикожного ведения аллергена - овальбумина). В сериях опытов с использованием глюкокортикостероида преднизолона (0,5 мг/кг) выраженность реакции активной кожной анафилаксии была в среднем на 81,6% меньше, чем в контроле. Соединение 2 уменьшает выраженность кожной анафилаксии на 36,4%, по сравнению с контролем в 1,57 раза. Соединение 2 уменьшает выраженность кожной анафилаксии на 60,5%.

2.6. Оценка ульцерогенности

Патология желудочно-кишечного тракта, связанная с приемом нестероидных противовоспалительных препаратов (НПВП), является актуальной и серьезной проблемой современной медицины.

Ульцерогенность соединений 1 и 2 оценивали на крысах (n=80) при однократном и субхроническом внутрижелудочном введении. Острую НПВС-индуцированную гастропатию вызывали путем однократного внутрижелудочного введения стабилизированной твином 80 суспензии препарата крысам, лишенным пищи за 16 часов до исследования. Через 3 часа животных подвергали эвтаназии передозировкой эфира для наркоза, извлекали желудки, рассекали их по малой кривизне и промывали в физиологическом растворе для удаления содержимого. Проводили визуальную оценку состояния слизистой оболочки желудка с использованием лупы при ярком освещении. Определяли число и площадь деструкций, которые дифференцировали на точечные кровоизлияния, эрозии и язвы. Ульцерогенность соединений 1 и 2 оценивали по значению индекса Паулса (ИП) [Pauls F., Wick A.M., МасКеу Е.М. et al., 1947].

Ульцерогенность соединений 1 и 2 оценивали при однократном внутрижелудочном введении крысам (n=20) в дозе соединения 1 0,2% от DL₅₀ (86,1 мг/кг) и при субхроническом внутрижелудочном введении (ежедневном в течение 4-х дней) крысам (n=20) в дозе соединения 1 0,05% от DL₅₀ (21,5 мг/кг). Доза для соединения 2 составляла 38,36 мг/кг.

В качестве препарата сравнения использовали НПВП неселективного действия с известной ульцерогенностью индометацин.

Сравнительную ульцерогенность индометацина оценивали в остром эксперименте при однократном внутрижелудочном введении крысам (n=20) в дозе 0,2 DL₅₀(10 мг/кг) и при субхроническом внутрижелудочном введении (ежедневном в течение 4-х дней) крысам (n=20) в дозе 0,05 DL₅₀ (2,5 мг/кг).

Анализ морфологических изменений слизистой оболочки желудков крыс, получавших внутрижелудочно индометацин, подтвердил наличие у последних выраженных ульцерогенных свойств. Так, при однократном введении индометацина в дозе 10 мг/кг (0,2 DL₅₀) через 3 часа у всех подопытных крыс были выявлены деструктивные изменения слизистой и серозной оболочек желудка. Установлено, что индометацин вызывал ярко выраженную гиперемию, отечность слизистой оболочки, гипертрофию желудочных складок, множественные точечные кровоизлияния и геморрагии, единичные глубокие дефекты, заполненные детритом. Кроме того, выявили множественные пристеночные сгустки крови, а также петехиальные кровоизлияния диаметром от 0,1 до 0,3 см.

Отмечено значительное количество точечных кровоизлияний (в среднем (р<0,05) 8,31 на одно животное), в то время как среднее количество эрозий и язв составило соответственно 1,21 и 2,16. Индекс Паулса составил 11,68 (таблица 6).

Анализ морфологических изменений слизистой и серозной оболочек желудков крыс, получавших однократно внутрижелудочно соединения 1 в дозе 86,1 мг/кг (0,2 DL₅₀) и в дозе 21,5 мг/кг (0,05 DL₅₀), показал, что слизистая оболочка желудков была серо-розовой с незначительной очаговой гиперемией, складки хорошо контурировались, отмечено полное отсутствие грубых язвенных повреждений и обширных кровотечений. Со стороны серозной оболочки отклонений от нормы обнаружено не было. Вместе с тем, у 35% подопытных животных было выявлено наличие незначительных деструктивных изменений.

Среднее количество незначительных точечных кровоизлияний на одно животное составило 2,12, что в 3,9 раза меньше, чем у животных, получавших внутрижелудочно индометацин. Также было отмечено, что количество эрозий на слизистой оболочке желудков крыс опытной группы было в 4,8 раз меньше, чем в группе сравнения, и составило в среднем (р<0,05) 0,25 на одно животное. Индекс Паулса у крыс, получавших однократно соединение 1, составил 0,83, что в 14 раз меньше, чем в группе сравнения.

При субхроническом введении значение индекса Паулса, характеризующего ульцерогенность, для соединения 1 в дозе 0,05 DL₅₀ (21,5 мг/кг) составило 0,19, что было в 61,9 раза (р<0,05) меньше, чем для индометацина в дозе 0,05 DL₅₀ (2,5 мг/кг).

Соединение 2 обладает меньшей ульцерогенной активностью, чем индометацин. Значение индекса Паулса при внутрижелудочном введении соединения 2 (38,36 мг/кг) было в 2,3 раза (р<0,05) меньше, чем при использовании индометацина (Таблица 6).

Проведенные эксперименты подтвердили выраженную ульцерогенность индометацина. При макроскопическом морфологическом исследовании желудка подопытных крыс, получавших внутрижелудочно индометацин (10 мг/кг), были выявлены выраженные изменения со стороны слизистой и серозной оболочек. Слизистая оболочка желудка была серо-белой, отечной со сглаженными складками и единичными глубокими дефектами, заполненными тканевым детритом. Кроме того, отмечались множественные пристеночные сгустки крови, а также петехиальные кровоизлияния диаметром от 0,1 до 0,3 см. Серозная оболочка желудка была гиперемирована, с выраженным сосудистым рисунком. Индекс Паулса при внутрижелудочном введении индометацина подопытным крысам составил 11,2.

Результаты макроскопических морфологических исследований показали, что в сериях опытов с использованием соединения (1) слизистая оболочка желудка была серо-розовой, складки хорошо контурировались, эрозивные дефекты не выявлялись, отмечалась незначительная очаговая гиперемия. Со стороны серозной оболочки отклонений от нормы выявлено не было.

Формула изобретения

Производные 5-этил-2-амино-1,3,4-тиадиазола, обладающие обезболивающей, противовоспалительной, противоаллергической и анальгетической активностями:

N-(5-этил-1,3,4-тиадиазол-2-ил)-амид N-ацетиламиногексановой кислоты (Соединение 1),

5-Этил-2-амино-1,3,4-тиадиазола сукцинат (Соединение 2),

5-Этил-2-амино-1,3,4-тиадиазола D,L-гидроксисукцинат (Соединение 3).

Изобретение "Производные 5-этил-2-амино-1, 3, 4-тиадиазола, обладающие обезболивающей, противовоспалительной, противоаллергической и анальгетической активностями" (Скачилова София Яковлевна, Желтухин Николай Константинович, Демидова Марина Александровна, Попов Никита Сергеевич, Казаишвили Юрий Георгиевич, Коротоножкин Алексей Викторович, Проскурина Оксана Владимировна, Ольхович Марина Васильевна, Перлович Герман Леонидович) отмечено юбилейной наградой (25 лет Российской Академии Естествознания)
Медаль Альфреда Нобеля

Оформление наградных документов и заказ каталога