СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ВЫСОКОЙ СТЕПЕНИ ФРАГМЕНТАЦИИ ДНК И НЕВЫНАШИВАНИЯ БЕРЕМЕННОСТИ В ПАРЕ

Название	СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ВЫСОКОЙ СТЕПЕНИ ФРАГМЕНТАЦИИ ДНК И НЕВЫНАШИВАНИЯ БЕРЕМЕННОСТИ В ПАРЕ
Разработчик (Авторы)	Чигринец Станислав Владимирович, Брюхин Геннадий Васильевич
Вид объекта патентного права	Изобретение
Регистрационный номер	2703455
Дата регистрации	17.10.2019
Правообладатель	Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Южно-Уральский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО ЮУГМУ Минздрава России)
Область применения (класс МПК)	G01N 33/48 (2006.01)
Медаль имени А.Нобеля

Описание изобретения

Предлагаемое изобретение относится к области медицины, а именно к андрологии, и может быть использовано для установления повреждения ДНК сперматозоидов химической природы.

Учащение обращений в центры планирования семьи и рост общего процента семей, страдающих бесплодием, являются тревожными знаками для перспективы будущего нации. «Критерий настороженности», установленный ВОЗ, или доля бесплодных семей, составляет 15% от общего количества. В Российской Федерации этот показатель еще больше и составляет 17%. По мнению экспертов в области демографии для прекращения процесса депопуляции в Российской Федерации необходимо, чтобы суммарный коэффициент рождаемости на одну женщину репродуктивного возраста составлял 2,1, который в настоящее время равен 1,62 [1,2].

Устранение сложившегося дисбаланса неразрывно связано с необходимостью решения проблемы патологии репродуктивной системы, к которой относится не только бесплодие, но и невынашивание беременности (Корякин, Акопян, 1995). С медицинской точки зрения уникальность этих патологических состояний связана с тем, что они являются результатом взаимодействия мужского и женского факторов -двух половых партнеров, состояние здоровья каждого из которых оказывает свое влияние на результат - появление на свет здорового потомства. Причины и механизмы невынашивания беременности остаются малоизученными, о чем свидетельствует значительная доля невынашивания с неизвестной причиной (до 40%) (Милованов, 1999). Вместе с тем, если материнские и плодовые факторы изучаются достаточно интенсивно, то оценке вклада мужского фактора как причины репродуктивных потерь и невынашивания беременности посвящен весьма ограниченный круг исследований.

Анализируя репродуктивные потери, связанные с мужским фактором, Артифексова [3] в своей работе делает следующие выводы: во-первых, морфофункциональные нарушения сперматозоидов, нередко не выявляемые при стандартном исследовании эякулята, сопровождаются после оплодотворения достоверно большей эмбриональной смертностью и увеличением процента аномалий внутриутробного развития. В связи с этим значение сперматозоидов не только в доставке генетического материала к яйцеклетке и индукции формирования зиготы, но и в поддержании развития зародыша на протяжении первых этапов беременности. Во-вторых, патозооспермия у отцов может стать причиной дисгинезии гонад у плодов, так, что репродуктивные проблемы сохраняются и в последующем поколении. И последнее, делается акцент на то, что требуется более активное обязательное включение мужчин в программу прегравидарной подготовки, так как, анализируя результативность применения стимулирующей сперматогенез терапии, которая широко используется в настоящее время, следует отметить, что разнообразные стимулирующие лечебные воздействия на гаметогенез у мужчин так же сопровождаются, несмотря на положительную динамику показателей спермограмм, увеличением числа спонтанных абортов, что может быть связано с ультраструктурными повреждениями сперматозоидов.

Так, наиболее частым ультраструктурным изменением сперматозоидов является фрагментация ядерной ДНК, представленная одно-двухцепочечными разрывами молекулы ДНК. Известно, что фрагментация ДНК сперматозоидов оказывает влияние на ранние этапы эмбриогенеза (оплодотворение, дробление с образованием бластоцисты), что определяет частоту наступления беременности в циклах ЭКО/ИКСИ [3].

Многие авторы считают, что повреждения ДНК сперматозоидов могут служить диагностическим маркером негативного отцовского эффекта в преимплантационный период развития человека [4-8]. Ряд исследований [2,3,9] показали прямую зависимость между высоким процентом повреждений ДНК сперматозоидов и частотой спонтанных абортов. Вместе с этим при наличии фрагментации ДНК сперматозоидов выше 30% прогнозируется практически нулевая вероятность оплодтворения in vitro и при ВМИ (внутриматочная инсеминация) [2]. Michel L. Eisenberg и соавт., проанализировав потерю одноплодной беременности в 98 парах с позиции мужского фактора (количество и концентрация сперматозоидов, их подвижность и морфология, а также индекс фрагментации ДНК сперматозоидов), пришли к выводу, что стандартные показатели спермограммы мало связаны с риском невынашивания беременности на популяционном уровне. Вместе с этим индекс ДНК фрагментации сперматозоидов >30% показал статистически значимую связь с невынашиванием беременности.

С другой стороны, известно, что в основе повреждающего действия ксенобиотиков, например триклозана, на организм человека лежит их способность индуцировать окислительный стресс, приводящий к нарушению клеточного энергетического и ионного гомеостаза, в том числе за счет повреждения митохондрий, изменения активности кальциевых и калиевых ионных каналов, стимуляции высвобождения кальция из внутриклеточных депо. Альтерация клеточных структур при этом может приобретать необратимый характер и индуцировать элиминацию клеток механизмами некроза и апоптоза. Повреждение ДНК клеток следует рассматривать, как неполную форму апоптоза. Влияние триклозана на повреждение ДНК клеток - способность вызывать фрагментацию ДНК, в том числе сперматозоидов, показано в работах (Martinez-Paz и соавт., 2013, Gao и соавт., 2015, Jurewicz и соавт., 2017).

Наиболее близким к предлагаемому является способ диагностики бесплодия и/или невынашивания беременности, включающий определение содержания триклозана в образцах мочи методом хроматографии с масс-спектрометрией, который широко используется в эпидемиологических и научных исследованиях (Jurewicz J., Radwan М., Wielgomas В.,  P., Klimowska A., Radwan P., Hanke W. Environmental levels of triclosan and male fertility. Environ. Sci. Pollut. Res. 2017; Dec 7. [Epub ahead of print]. https://doi.org/10.1007/s11356-017-0866-5).

Однако, данный метод имеет существенный недостаток, так как не оценивает прямое действие репротоксиканта на качество сперматозоидов, о чем в своих работах указывают ряд исследователей (Zhu W., et al., 2016; Den Hond, et al., 2015).

Способ диагностики мужской инфертильности и/или субфертильности (снижение стандартных показателей спермы: количество, подвижность и морфология сперматозоидов), связанных с повышенной концентрацией триклозана в семенной жидкости, измеренной с помощью метода газовой хроматографии с масс-спектрометрией, был предложен нами ранее (патент на изобретение №2675856 от 25 декабря 2018 г).

Задачей заявляемого решения является разработка способа диагностики бесплодия и/или невынашивания беременности методом газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием и вычисление точки разделения (cut-off) для концентрации триклозана в семенной жидкости с целью оценки риска высокого уровня фрагментации ДНК сперматозоидов. Нормативным значением степени фрагментации ДНК сперматозоидов обще принято считать 15% и менее (низкий риск нарушения фертильности и вынашивания беременности).

Техническим результатом предлагаемого способа является повышение точности дифференциальной диагностики идиопатической и химической природы фрагментации ДНК сперматозоидов.

Технический результат достигается тем, что способ диагностики химической природы фрагментации ДНК сперматозоидов включает исследование семенной жидкости на триклозан.

Отличие способа заключается в том, что проводят определение концентрации триклозана в семенной жидкости и при обнаружении эндокринного дизраптора в концентрации ≥0,11 нг/мл при фрагментации ДНК сперматозоидов ≥15% делается заключение о химической природе повреждения генетического материала с высоким риском невынашивания беременности как при естественном зачатии, так и в программах ВРТ.

Проведенный анализ специальной и патентной литературы показал, что предлагаемый способ не имеет аналогичных решений по диагностике химической природы фрагментации ДНК сперматозоидов, связанной с содержанием триклозана в семенной жидкости ≥0,11 нг/мл. Следовательно, предлагаемое техническое решение соотвествует критерию изобретения "новизна".

Авторами заявляемого способа впервые проведено исследование эякулята на наличие и количественное содержание триклозана в семенной жидкости с вычислением точки разделения по концентрации эндокринного дизраптора с целью прогноза высокого риска фрагментации ДНК сперматозоидов и невынашивания беременности в супружескоцй паре.

Данный способ предназначен для использования в сфере здравоохранения и может быть применен с целью диагностики фрагментации ДНК сперматозоидов химической природы в андрологических, эндокринологических отделениях, клиниках и медицинских центрах репродуктивного здоровья.

Таким образом, предлагаемый "Способ диагностики мужского бесплодия и/или невынашивания беременности" соответствует критериям "изобретательский уровень" и "промышленная применимость".

Предлагаемый способ заключается в том, что у мужчин, обследуемых по поводу бесплодия и/или невынашивания беременности в браке, в образцах эякулята определяют концентрацию триклозана методом газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием с последующим сравнением, полученного результата с разработанной нами точки разделения (cut-off).

С целью разработки cut-off для концентрации триклозана в семенной жидкости нами был проведен ROC- анализ клинической базы пациентов (n=51), обратившихся в клинику по лечению бесплодия, в ходе которого была определена точка разделения (cut-off) для концентрации триклозана в семенной жидкости у мужчин с фрагментацией ДНК сперматозоидов <15% и ≥15% (высокий риск нарушения фертильности и вынашивания беременности в браке).

При статистической обработке полученных данных (ROC- анализ) была определена площадь под ROC - кривой, которая соответствует взаимосвязи прогноза высого риска нарушения фертильности и вынашивания беременности в браке и концентрации триклозана в семенной жидкости у мужчин и составила 0,839±0,071 с 95% ДИ: 0,699-0,979 (р=0,001) (приложение №1).

Пороговое значение концентрации триклозана в точке cut-off составило 0,11 нг/мл. При концентрации триклозана в семенной жидкости равном или превышающем данное значение прогнозировался высокий риск бесплодия (патозооспермии). Чувствительность и специфичность метода составила 85% и 77% соответственно.

Сущность заявляемого способа диагностики бесплодия и/или невынашивания беременности поясняется примерами из клинической практики.

Формула изобретения

Способ прогнозирования высокой степени фрагментации ДНК сперматозоидов и невынашивания беременности в паре, включающий исследование эякулята на содержание триклозана, отличающийся тем, что при обнаружении концентрации триклозана ≥0,11 нг/мл методом газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием устанавливается высокий риск фрагментации ДНК сперматозоидов и невынашивания беременности в паре.

Изобретение "СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ВЫСОКОЙ СТЕПЕНИ ФРАГМЕНТАЦИИ ДНК И НЕВЫНАШИВАНИЯ БЕРЕМЕННОСТИ В ПАРЕ" (Чигринец Станислав Владимирович, Брюхин Геннадий Васильевич) отмечено юбилейной наградой (25 лет Российской Академии Естествознания)
Медаль Альфреда Нобеля

Оформление наградных документов и заказ каталога