Способ прогнозирования прогресса папилломавирусной инфекции у пациенток с хроническим рецидивирующим ВПЧ - ассоциированным цервицитом

Название	Способ прогнозирования прогресса папилломавирусной инфекции у пациенток с хроническим рецидивирующим ВПЧ - ассоциированным цервицитом
Разработчик (Авторы)	Лемякина Елена Викторовна
Вид объекта патентного права	Изобретение
Регистрационный номер	2646785
Дата регистрации	07.03.2018
Правообладатель	Общество с ограниченной ответственностью "Медстарт"
Область применения (класс МПК)	G01N 33/53 (2006.01)

Описание изобретения

Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии, и может быть использовано в гинекологических стационарах и амбулаторных условиях женских консультаций и поликлиник для прогнозирования прогресса папилломавирусной инфекции у пациенток с хроническим рецидивирующим ВПЧ-ассоциированным цервицитом.

Цель изобретения - повышение точности прогнозирования прогресса ПВИ у пациенток с ВПЧ-ассоциированным цервицитом, что позволит выбрать правильную тактику ведения.

Актуальность разработанного способа определяется высокой частотой заболеваний шейки матки, ассоциированных с папилломавирусной инфекцией (ПВИ), поскольку характеризуются выраженной контагиозностью и высоким онкогенным потенциалом вируса [Хронический цервицит и ВПЧ-инфекция в репродуктивном возрасте. Пути снижения диагностической и лечебной агрессии / Т.С. Качалина, Н.М. Шахова, О.В. Качалина и др. // Акушерство, гинекология и репродукция. - 2012. - №4. - С. 6-12]. В настоящее время длительная персистенция вируса папилломы человека (ВПЧ) рассматривается как этиологический фактор дисплазии шейки матки, с высоким риском последующего озлокачествления, что неоднократно подтверждено работами отечественных и зарубежных исследователей [Хронический цервицит и ВПЧ-инфекция в репродуктивном возрасте. Пути снижения диагностической и лечебной агрессии / Т.С. Качалина, Н.М. Шахова, О.В. Качалина и др. // Акушерство, гинекология и репродукция. - 2012. - №4. - С. 6-12; Nagai Y. Persistence of human papillomavirus infection after therapeutic conization for CIN 3: is it an alarm for disease recurrence? / Y. Nagai, T. Maehama, T. Asato, K. Kanazawa // Gynecol Oncol. - 2000. - Vol. 79, N 2. - P. 294-299]. По результатам отечественных исследований среднее время элиминации ВПЧ в возрасте 18-25 лет составляет от 1,5 до 2 лет у каждой второй пациентки. Актуальность проблемы объясняется существенным «омоложением»: каждый пятый рак диагностируется в возрастной группе от 15 до 39 лет, а 42,4% выявленных CIN II-CIN III - до 35 лет [Бычкова, О.С. Современные представления о папилломавирусной инфекции у детей и подростков: эпидемиология, этиология и патогенез (обзор литературы) [Текст] / О.С. Бычкова В.Ф. Коколина // Репродуктивное здоровье детей и подростков. - 2010. - №1. - С. 43-49]. Одним из ключевых звеньев патогенеза хронизации процесса является нарушение соотношения про- и противовоспалительных цитокинов. Нарушение иммунологического равновесия ведет к запуску самоподдерживающегося вялотекущего воспалительного процесса, развитию вторичного иммунодефицитного состояния. В настоящее время в клинических исследованиях изучение цитокинов используют как достоверный диагностический инструмент прогнозирования течения и исхода инфекционного процесса. В то же время активация или угнетение цитокинов зависит от функционирования врожденного иммунитета, за который отвечают TLR. Одним из современных направлений развития диагностики предраковых и онкологических заболеваний стало определение в сыворотке крови онкомаркеров при помощи иммуноферментного анализа. В настоящее время для оценки распространенности опухолевого процесса и динамики его течения активно используется уровень экспрессии онкосупрессора р53, активно участвующего в апоптозе и онкомаркера p16INK4α, выявляемого практически в 100% случаев при раке шейки матки [Кондриков Н.И. Значение иммуногистохимического определения биомаркеров плоскоклеточных интраэпителиальных поражений шейки матки // Акушерство и гинекология. - 2010. - с. 44-47].

Известны следующие способы прогнозирования прогрессирования ПВИ:

1. Способ прогнозирования рака шейки матки при доброкачественных и предраковых процессах шейки матки у женщин репродуктивного возраста. Данный способ включает в себя определение клинических факторов риска развития рака шейки матки, метилирования генов MLH1, HIC1, RASSF1A, MGMT, N33, CDH1 в биоптате шейки матки и расчет коэффициента вероятности развития рака шейки матки p, где:

p - коэффициент вероятности риска развития рака шейки матки;

e - основание натурального логарифма, равное 2,71828182845904;

z=2,4274+2,2163*X1+0,3791*X1+0,528*X3+1,1373*X4+1,2187*X5+2,1587*X6+26,5802*X7+1,3323*Х8+1,9323*Х9+1,8596*Х10+1,6689*Х11+1,2123*Х12+1,0690*Х13;

X1 - морфотип (доброкачественные процессы - 1, CIN I - 2, CIN II - 3, CIN III - 4),

Х2 - метилирование MLH1 (значения: есть - 1, нет - 0),

Х3 - метилирование MGMT (значения: есть - 1, нет - 0),

Х4 - метилирование N33 (значения: есть - 1, нет - 0),

Х5 - метилирование RASSF1 (значения: есть - 1, нет - 0),

Х6 - метилирование HIC1 (значения: есть - 1, нет - 0),

Х7 - метилирование CDH1 (значения: есть - 1, нет - 0),

Х8 - ВПЧ высокого риска (значения: есть - 1, нет - 0),

Х9 - дисплазия шейки матки в анамнезе (значения: есть - 1, нет - 0),

X10 - эрозия шейки матки в анамнезе (значения: есть - 1, нет - 0),

X11 - травмы шейки матки после родов/абортов (значения: есть - 1, нет - 0),

X12 - ИППП (значения, есть - 1, нет - 0);

Х13 - отягощенная онкологическая наследственность (значения: есть - 1, нет - 0) и при величине р больше 0,6 прогнозируют высокую вероятность риска развития рака шейки матки, при р, равном 0,3-0,59, - умеренную вероятность, при р меньше 0,29 - низкую вероятность. На основании полученных данных можно определить 3 группы пациенток:

- с низкой вероятностью развития рака - р=0,0-0,29;

- с умеренной вероятностью развития рака - р=0,3-0,59;

- с высокой вероятностью развития рака - р=0,6-1,0.

В предлагаемой формуле должен указываться морфотип (доброкачественные процессы - 1, CIN I - 2, CIN II - 3, CIN III - 4), однако не всегда папилломавирусная инфекция на начальных этапах либо в случае рецидивирования после хирургического лечения имеет клинические проявления на шейке матки до CIN 1-3). Кроме того, данная формула достаточно загромождена переменными и трудна для восприятия практикующему врачу-гинекологу. Это является недостатками данного способа.

2. Способ прогнозирования варианта течения заболевания у больных с плоскоклеточными эпителиальными поражениями низкой степени на фоне папилломавирусной инфекции.

В заявленном способе используют последовательный анализ Вальда. Рассчитывают диагностический коэффициент ДК для каждого из признаков по формуле ДК=101g*(P1/P2), где Р1 - относительная частота признака при первом верифицируемом состоянии, выраженная в долях единицы; Р2 - относительная частота признака при втором верифицируемом состоянии. Учитывают такие признаки, как: вирусная нагрузка вируса папилломы человека (ВПЧ) 16, 18 типов; клинико-кольпоскопический индекс; иммуногистохимический индекс p16ink4α; возраст; начало половой жизни; интервал от менархе до сексуального дебюта. При сумме ДК менее минус 13 битов вероятность благоприятного исхода LSIL составляет 95%, при ДК от плюс 13 до плюс 19 битов вероятность перехода LSIL в плоскоклеточное интраэпителиальное поражение высокой степени (HSIL) составляет 95%, при ДК более плюс 20 битов - вероятность 99%. Способ позволяет прогнозировать вариант течения плоскоклеточного интраэпителиального поражения низкой степени на фоне папилломавирусной инфекции. Недостатком известного способа является ограниченность применения данного способа только для пациенток с диагностированной ЦИН низкой степени.

Заявляемый способ осуществляется следующим образом.

На первом этапе в одноразовую пластиковую пробирку с 200 мкл раствора антикоагулянта (0,05М раствор ЭДТА) собиралось 2000 мкл венозной крови пациенток с ВПЧ-ассоциированным цервицитом. Затем в пробирку типа «Эппендорф» с замком вносилась цельная кровь в количестве 1000 мкл и центрифугировалась со скоростью 3000 об/мин на высокоскоростной центрифуге «MiniSpin» («Eppendorf», Германия) при комнатной температуре в течение 5 мин, плазма удалялась пипеткой и пробирка выдерживалась при -20°C в течение 1 часа. Содержимое полностью размораживалось при комнатной температуре, и в пробирку вносился реактив «ДНК-экспресс-кровь» в соотношении 500 мкл цельной крови к 500 мкл реактива. Полученная смесь тщательно перемешивалась на микроцетрифуге-вортексе «MicroSpin FV-2400» (Biosan, Латвия). Затем пробирка со смесью прогревалась при 99°C в течение 15 минут в твердотельном термостате «Гном» (НПФ «ДНК-технология», Россия). Полученный супернатант использовался в качестве исследуемого образца ДНК.

На втором этапе готовились рабочие смеси реагентов для амплификации с реакционной смесью НОРМА и ПАТОЛОГИЯ из расчета на 1 пробу: 17,5 мкл разбавителя, 2,5 мкл реакционной смеси, 0,2 мкл Taq-полимеразы. Пробирки центрифугировались в течение 3-5 секунд при 1500-3000 об/мин на микроцентрифуге-вортексе, затем переносились в прогретый до температуры +94°C программируемый термостат (амплификатор) «Терцик» (НПФ «ДНК-технология», Россия) с точным типом регулирования, и проводилась амплификация.

На конечном этапе проводилось разделение продуктов амплификации методом горизонтального электрофореза по следующей схеме:

1. В аппарат для электрофореза заливался ТАЕ буфер, приготовленный на дистиллированной воде разбавлением 50×ТАЕ в 50 раз (pH=8,3).

2. Готовилась 3% агароза из расчета на 1 гель: к 1,5 г агарозы добавить 1 мл 50×ТАЕ буфера и 55 мл дистиллированной воды (включен запас на испарение).

3. Приготовленная смесь расплавлялась на электрической плите на небольшой мощности. К 50 мл расплавленной агарозы добавлялось 5 мкл 1% раствора бромистого этидия.

4. Расплавленная агароза сразу же заливалась в планшет для заливки геля. Для получения в агарозном геле карманов для нанесения образцов устанавливалась на планшет гребенка, используя зажим типа «бульдог», после застывания геля зажим убирался.

5. В карманы геля наносилось по 10 мкл амплификата в последовательности, соответствующей нумерации проб.

6. Подключалась электрофоретическая камера к источнику питания и задавалось напряжение, соответствующее напряженности электрического поля 10-15 В/См геля. Проводилось электрофоретическое разделение продуктов амплификации в направлении от катода (-) к аноду (+) в течение 15 мин. Контроль за электрофоретическим разделением осуществлялся визуально по движению полосы красителя.

7. Гель из формы переносился на стекло УФ-трансиллюминатора и результаты анализировались визуально с защитным экраном и при помощи программы. Фрагменты анализируемой ДНК проявлялись в виде светящихся оранжево-красных полос под УФ-излучением с длиной волны 310 нм. Результаты интерпретировались в следующих вариантах: нормальная гомозигота, гетерозигота, мутантная гомозигота.

При выявлении у пациентки аллеля Ser в гене TLR6 и гомозиготного генотипа Pro/Pro или Arg/Arg в гене ТР53 прогнозируют низкий риск прогрессирования ПВИ; при выявлении у пациентки мутации Pro/Pro в гене TLR6 либо гетерозиготного генотипа Pro/Arg в гене ТР53 прогнозируют средний риск прогрессирования ПВИ; при определении у пациентки мутации Pro/Pro в гене TLR6 и гетерозиготного генотипа Pro/Arg в гене ТР53 прогнозируют высокий риск прогрессирования ПВИ.

Предлагаемый способ основан на следующем исследовании.

На первом этапе были обследованы 48 пациенток с ВПЧ-ассоциированным хроническим цервицитом и 24 женщины без патологии шейки матки. Пациентки с ВПЧ-ассоциированным цервицитом вошли в основную группу. Контрольную группу составили женщины без патологии шейки матки. Группы были идентичны по возрастному, соматическому и психологическому исходному состоянию.

Критерии включения: пациентки с ВПЧ-ассоциированным хроническим рецидивирующим цервицитом.

Критерии исключения: отсутствие ПВИ у пациентки, экстрагенитальная патология инфекционного генеза, РШМ, нежелание самой женщины.

В ходе исследования были изучены взаимосвязи точечных нуклеотидных мутаций промоторных участков генов большинства цитокинов и TLR. Определялись генетические полиморфизмы TLR: Мутация 1 толл-подобного рецептора 9, полиморфизма A2848G в гене TLR9, Мутация толл-подобного рецептора 2, полиморфизма Arg753Gln в гене TLR2, Мутация толл-подобного рецептора 3, полиморфизма Phe412Leu в гене TLR3, Мутация толл-подобного рецептора 4, полиморфизма Asp299Gly в гене TLR4, Мутация 2 толл-подобного рецептора 4 TLR4 Thr399lle (rs4986791), Мутация толл-подобного рецептора 6, полиморфизма Ser249Pro в гене TLR6, Мутация толл-подобного рецептора 9, полиморфизма Т-1237С в гене TLR9.

Определялась мутация белка р53 ТР53 (Pro47Ser) и мутация 2 белка р53 ТР53 (Pro72Arg).

Также изучались генетические полиморфизмы интерлейкинов: Мутация интерлейкина 2, полиморфизма T-330G в гене IL2, Мутация интерлейкина 6, полиморфизма C-174G в гене IL6, Мутация - 3 интерлейкина 10, полиморфизма С-819Т в гене IL10, Мутация интерлейкина 12В, полиморфизма А1188С в гене IL12B, Мутация интерлейкина 1b полиморфизма Т-31С в гене IL1b, Мутация 2 интерлейкина 1b IL1b Т-511С, Мутация интерлейкина 4 IL4 С-589Т, Мутация - 1 интерлейкина 10 IL10 G-1082А, Мутация интерлейкина 17А IL17A G-197A.

В ходе молекулярно-генетического исследования при сравнении частот встречаемости аллелей и генотипов полиморфных маркеров генов цитокинов у обследованных женщин групп не было выявлено статистически значимых отличий.

При сравнении частот встречаемости аллелей и генотипов полиморфных маркеров в гене ТР53 выявлена значительная вариабельность в генотипах гена Pro72Arg, при анализе полиморфизма Arg72Pro в гене ТР53 значимых различий не выявлено.

Частоты встречаемости аллелей и генотипов полиморфного маркера гена Pro72Arg в гене ТР53 выявило вариабельность в генотипах в группах сравнения, за счет гетерозиготного генотипа Pro/Arg, который встречался у пациенток с ВПЧ-ассоциированным цервицитом чаще в 2 раза (58,3% против 29,2% соответственно в контрольной группе) (p<0,01) (табл. 1).

При сравнении частот встречаемости аллелей и генотипов полиморфных маркеров TLR выявлена значительная вариабельность в генотипах гена TLR6. При сравнении частот встречаемости аллелей и генотипов полиморфных маркеров TLR выявлена значительная вариабельность в генотипах гена TLR6.

Частоты встречаемости аллелей и генотипов полиморфного маркера гена TLR6 распределились следующим образом: аллель Pro встречалась чаще у пациенток основной группы, чем в контрольной - 58,4% против 30,2%, а аллель Ser встречалась реже - в 41,6% и 69,8% случаях соответственно. Также отмечено значимое увеличение частоты мутантных гомозигот Pro/Pro у больных основной группы, что в 12,5 раза чаще, чем в контрольной - 50% против 4,1% (p<0,01). У каждой второй обследованной пациентки была определена гомозигота Pro/Pro. Количество гетерозигот Ser/Pro значимо различалось, за счет повышения генотипа Pro/Pro у пациенток основной группы. Частота встречаемости нормальной гомозиготы Ser/Ser не отличались - 33,3% против 50,0%. (табл. 2).

При дальнейшем анализе выявлена зависимость между наличием мутантной гомозиготы Pro/Pro TLR6 у больных основной группы и длительностью заболевания. Так, средняя продолжительность заболевания на момент обследования у женщин без мутации в гене TLR6 в основной группе составила - 2,5±1,2 года, а у пациенток, носительниц мутантной гомозиготы Pro/Pro гена TLR 6, - 3,9±1,01 год (p<0,01) (табл. 3).

После выявления значимых различий на основе молекулярно-генетического анализа группа с ВПЧ-ассоциированным хроническим рецидивирующим цервицитом была разделена на две клинические подгруппы: 1 и 2, в которых были проанализированы иммуногенетические особенности обследуемых. В подгруппу №1 вошло 30 пациенток с ВПЧ-ассоциированным хроническим рецидивирующим цервицитом с нарастанием количественной вирусной нагрузки ПВИ в динамике, в подгруппу №2 - 18 пациенток с ВПЧ-ассоциированным хроническим цервицитом с уменьшением вирусной количественной нагрузки в динамике. Для определения значимости различий исходов в зависимости от воздействия фактора риска и оценки силы связи между фактором риска и исходом использовались таблицы сопряженности (табл. 4, 5)

Таким образом, сила связи между наличием у пациенток с ВПЧ-ассоциированным хроническим рецидивирующим цервицитом гетерозиготного генотипа Pro/Arg в гене ТР53, мутантной гомозиготы Pro/Pro TLR6 и прогрессированием ПВИ определена как сильная (p<0,01).

Преимуществами заявляемого способа является:

1. Способ позволяет достоверно спрогнозировать прогресс ПВИ у пациенток хроническим, рецидивирующим, ВПЧ-ассоциированным цервицитом.

2. Способ является простым и доступным для практических врачей и может использоваться в амбулаторных условиях.

3. Способ не требует применения многочисленных дорогостоящих реактивов, оборудования и позволяет снизить материальные затраты при диагностике данной патологии, в связи с чем является более рациональным и экономически оправданным.

Формула изобретения

Способ прогнозирования прогресса папилломавирусной инфекции у пациенток с хроническим рецидивирующим ВПЧ-ассоциированным цервицитом, заключающийся в том, что у пациентки определяют генотипы полиморфизмов Ser249Pro в гене TLR6 и Pro72Arg в гене ТР53 и при выявлении у пациентки аллеля Ser в гене TLR6 и гомозиготного генотипа Pro/Pro или Arg/Arg в гене ТР53 прогнозируют низкий риск прогрессирования ПВИ; при выявлении у пациентки мутации Pro/Pro в гене TLR6 либо гетерозиготного генотипа Pro/Arg в гене ТР53 прогнозируют средний риск прогрессирования ПВИ; при определении у пациентки мутации Pro/Pro в гене TLR6 и гетерозиготного генотипа Pro/Arg в гене ТР53 прогнозируют высокий риск прогрессирования ПВИ.

Изобретение "Способ прогнозирования прогресса папилломавирусной инфекции у пациенток с хроническим рецидивирующим ВПЧ - ассоциированным цервицитом" (Лемякина Елена Викторовна) отмечено юбилейной наградой (25 лет Российской Академии Естествознания)
Медаль Альфреда Нобеля

Оформление наградных документов и заказ каталога