СРЕДСТВО ДЛЯ РАННЕГО КОНТРАСТНОГО МРТ ВЫЯВЛЕНИЯ ЦЕНТРОВ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОЙ ПРОЛИФЕРАЦИИ С ПИТАЮЩИМИ СОСУДАМИ, ГРАНИЦАМИ ДИФФУЗНОЙ ИНФИЛЬТРАЦИИ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТАДИЙ ИХ РАЗВИТИЯ В ДИНАМИКЕ

Название	СРЕДСТВО ДЛЯ РАННЕГО КОНТРАСТНОГО МРТ ВЫЯВЛЕНИЯ ЦЕНТРОВ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОЙ ПРОЛИФЕРАЦИИ С ПИТАЮЩИМИ СОСУДАМИ, ГРАНИЦАМИ ДИФФУЗНОЙ ИНФИЛЬТРАЦИИ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТАДИЙ ИХ РАЗВИТИЯ В ДИНАМИКЕ
Разработчик (Авторы)	Брусенцов Николай Антонович, Голубева Ирина Сергеевна, Борисова Лариса Михайловна, Бочарова Ольга Алексеевна , Пирогов Юрий Андреевич, Анисимов Николай Викторович, Гуляев Михаил Владимирович
Вид объекта патентного права	Изобретение
Регистрационный номер	2692579
Дата регистрации	25.06.2019
Правообладатель	Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ)
Область применения (класс МПК)	A61B 5/055 (2006.01) A61K 49/06 (2006.01) B82B 3/00 (2006.01) C23C 18/22 (2006.01) C23C 22/05 (2006.01)

Описание изобретения

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к экспериментальной медицине и касается средства и способа раннего (через 48-72 ч после перевивки) контрастного магнитно-резонансного томографического (КМРТ) выявления центров злокачественной пролиферации (ЦЗП) с питающими сосудами, границами диффузной инфильтрации злокачественных клеток в нормальные ткани и определение стадий их развития в динамике in vivo.

Уровень техники

Разработка способов ранней диагностики и терапии злокачественных опухолей является актуальной биомедицинской задачей. Злокачественные опухоли (ЗО) образуются в результате развития ЦЗП и могут содержать от одного до нескольких первичных, вторичных, третичных и т.д. ЦЗП, фигуры 1 (g, h, r, v, w); 4 (b, с); 5 (a, b, с, d, e, f); 9 (a, b); 10 (c, d, e, f, g, h); 11 (e). До настоящего времени не были известны способы раннего выявления ЦЗП злокачественных глиом и других солидных опухолей. Разработка способов ранней диагностики и терапии ЦЗП является актуальной. Практически ранняя диагностика ЦЗП начинается с имплантации ЗК определенного штамма в нормальные ткани животного и осуществляется одновременно с КМРТ определением прививаемости данного штамма злокачественных клеток (ЗК). Традиционно через 5-7 дней после подкожного введения ЗК место прививки пальпируют, размеры опухоли определяют с помощью микрометра и выбраковывают животных, у которых опухоли не выросли. Большинство штаммов ЗК мышиных и крысиных опухолей имеют прививаемость от 85 до 100% [Л.Ф. Ларионов. Химиотерапия злокачественных опухолей, Мед. Лит. М. 1962, с. 16-18]. Ранняя КМРТ визуализация глиальных ЦЗП начинается с инъекции злокачественных глиальных клеток (ЗГК) в нормальные ткани мозга через имплантационное отверстие в черепе животного и совпадает по времени с ранним КМРТ определением прививаемости данного штамма. Через 2-3 дня проводят КМРТ сканирование места интрацеребрального введения ЗГК, размеры ЦЗП глиомы С6 и глиобластомы 101/8 определяют по формуле (4) и выбраковывают животных, у которых ЦЗП не визуализировались или не соответствовали стандартным размерам. Прививаемость злокачественных глиальных клеток (ЗГК) от 44 до 100%.

В настоящее время не известны способы полного излечения запущенных злокачественных глиом и других солидных опухолей. Однако хорошо известен способ излечения опухолей, выявленных до инфильтрации злокачественных клеток (ЗК) в нормальные ткани. Поэтому особенно актуально раннее выявление центров злокачественной пролиферации с питающими сосудами, границ диффузной инфильтрации злокачественных клеток (ЗК) в нормальные ткани с определением стадий их развития в динамике. Кроме того, эффективный мониторинг развития злокачественных опухолей важен при проведении исследований, направленных на разработку и тестирование противоопухолевых препаратов. Например, при карциноме Эрлиха латентный период после перевивки длится 4-6 дней [Л.Ф. Ларионов. Химиотерапия злокачественных опухолей, Мед. Лит. М. 1962, с. 15]. Традиционно терапию злокачественных глиальных опухолей начинают через 6-14 дней после интрацеребральной перевивки, без предварительного КМРТ исследования с целью контроля прививаемости, без учета возможной инфильтрации и метастазирования. Это приводит к разбросу результатов и делает их статистически недостоверными.

Раскрытие изобретения

Задачей настоящего изобретения является:

- создание способа получения средства раннего (через 48-72 ч после перевивки) контрастного магнитно-резонансного томографического (КМРТ) выявления центров злокачественной пролиферации (ЦЗП) с визуализацией питающих сосудов и границ диффузной инфильтрации злокачественных клеток (ЗК) в нормальные ткани с определением стадий их развития в динамике;

- разработка способа применения полученного средства при КМРТ исследовании в эксперименте на иммунокомпетентных животных с перевиваемыми злокачественными опухолями.

Техническим результатом, достигаемым заявленной группой изобретений, является:

- способ синтеза заявляемого средства, представляющего собой ферримагнитные наночастицы цитратферрита (ФНЦФ) диаметром от 9 до 130 нм в комбинации с магневистом;

- подбор комбинации негативного и позитивного контрастного средства и оптимальных параметров КМРТ сканирования тела животного для выявления ЦЗП с питающими сосудами и границами диффузной инфильтрации, и определение стадий их развития в динамике.

Заявляемый способ на основе контрастной магнитно-резонансной томографической (КМРТ) визуализации обеспечивает:

- успешное применение заявляемого средства для раннего (через 48-72 ч после перевивки) КМРТ выявления центров злокачественной пролиферации (ЦЗП) с питающими сосудами, границами диффузной инфильтрации злокачественных клеток в нормальные ткани в динамике;

- определение стадий развития ЦЗП в динамике в эксперименте на иммунокомпетентных животных с перевиваемыми злокачественными опухолями.

Раннюю визуализацию КМРТ изображений ЦЗП с питающими сосудами и границами инфильтрации реализуют через 2-3 дня после перевивки опухоли ВВ введением заявляемых соединений общей формулы (Fe₃O₄⁺)m (C₆H₇O₇^-)n за 12 мин - 45 ч до КМРТ мониторинга, и ВВ введением магневиста® за 3-9 мин до КМРТ мониторинга, этим создают контраст, сокращают время МРТ релаксации T1, Т2, Т*2 и время ранней КМРТ визуализации T1, Т2, Т*2 взвешенных 3D КМРТ изображений, кроме того, сокращают время необходимое для выявления центров злокачественной пролиферации с границами инфильтрации с определением стадий их развития в динамике от 72 до 264 ч (от 3 до 11 дней).

Поставленная задача решается посредством разработки нового средства для раннего контрастного магнитно-резонансного томографического исследования, представляющего собой водный золь на основе ферримагнитных наночастиц цитратферрита общей формулы (Fe₃O₄⁺)m⋅(C₆H₇O₇^-)n, где: m от 14 масс % до 29 масс % и n от 71 масс % до 86 масс %, предпочтительно m от 16 масс % до 27 масс % и n от 73 масс % до 84 масс %;

- (Fe₃O₄)m содержит от (Fe²_1,01⁺O⋅Fe³⁺_1,99О₃)m до (Fe²_1,30⁺O⋅Fe³⁺_1,70O₃)m, предпочтительно от ;

- (С₆Н₇О₇^-)n цитратанионы, содержащиеся в поверхностном слое ферримагнитных наночастиц, химически связанные с окисью железа;

- наночастицы в водном золе содержатся в количестве от 0,1 до 50 масс %, предпочтительно от 2,0 до 40 масс %;

- гидродинамический диаметр наночастиц составляет от 9 до 130 нм, намагниченность насыщения (Ms) от 8,3 кА/м до 8,9 кА/м; рН золя от 6,6 до 6,9, ζ потенциал -31±5 мВ, релаксивность 4550 мл⋅мг-1 с-.

Острая токсичность при внутривенном введении ЛД₅₀ мышей C57Bl/6j 1,0 г/кг, ЛД₅₀ крыс Вистар 1,7 г/кг.

Для получения заявляемого средства проводят синтез ферримагнитных нанокристаллов, при котором Fe²⁺O и Fe³⁺₂О₃ находятся в соотношении от 1,01/1,99 до 1,3/1,7, предпочтительно 1,15/1,85, структуры шпинели, кубической формы, общей формулы: Fe₃O₄, где Fe₃O₄ содержит от (1,15Fe²⁺O⋅1,85Fe³⁺О₃)m до (1,30Fe²⁺O⋅1,70Fe³⁺O₃)m, предпочтительно от (1,05Fe²⁺O⋅1,95Fe³⁺O₃)m до (1,15Fe²⁺O⋅1,85Fe³⁺O₃)m (1).

Затем кубические ферримагнитные нанокристаллы общей формулы (1) обрабатывают от 2 до 10 ч 36% хлористоводородной кислотой, предпочтительно от 4 до 6 ч. Получают активированные ферримагнитные наночастицы округлой формы, общей формулы от (1,05Fe²⁺O⋅1,85Fe³⁺O₃⋅0,1Fe³⁺OCl)m до (1,15Fe²⁺O⋅1,75Fe³⁺O₃⋅0,1Fe³⁺OCl)m (2), при этом количественное содержание в водном золе нанокристаллов соединения формулы (1,05Fe²⁺O⋅1,85Fe³⁺O₃⋅0,1Fe³⁺OCl) составляет от 10 масс % до 40 масс %. Диаметр, которых составляет от 5 до 11 нм, отличающиеся структурой шпинели, округлой формой, и поверхностью, состоящей из анионов Cl^-, защищающих их от слипания.

Покрытие наночастиц общей формулы (2), цитратанионами, путем замещения анионов Cl^- на цитратанионы ведут при +80-+90°С и перемешивании от 300 до 1500 об/мин, предпочтительно от 500 до 1000 об/мин, рН от 3,5 до 6,9, до образования водного золя соединений общей формулы (3);

Поставленная задача решается также посредством способа контрастного магнитно-резонансного томографического выявления центров злокачественной пролиферации с питающими сосудами и расширяющейся границей диффузной инфильтрации злокачественных клеток в нормальные ткани в эксперименте, включающий:

- внутривенное введение лабораторным животным от 0,1 до 10 мл/кг, предпочтительно от 0,2 до 5,0 мл/кг, от 2% до 5% водного золя соединений общей формулы (Fe₃O₄⁺)m⋅(С₆Н₇О₇^-)n за 10 мин - 75 ч до КМРТ сканирования исследуемой области и первичное внутривенное введение от 0,1 до 2,0 мл/кг магневиста® за 3-9 мин до КМРТ сканирования, которые вызывают раннюю КМРТ визуализацию развития центров злокачественной пролиферации с питающими сосудами, расширяющейся границей диффузной инфильтрации злокачественных клеток в нормальные ткани в течение 75 ч с

перерывами;

- проведение КМРТ сканирования тканей в режимах получения T₁ В {600/15 [время повторения, мс/время эхо, мс], Т₂ В (1950/85) спин эхо, Т₂ В градиент эхо (600/13) и Т*₂ В градиент эхо (550/15)};

- повторное внутривенное введение от 0,1 до 0,2 мл/кг магневиста® за 3-5 мин до КМРТ сканирование исследуемой области, с визуализацией границ диффузной инфильтрации ЗК в нормальные ткани и вторичное внутривенное введение от 0,1 до 1,0 мл/кг, от 2% до 5% водного золя соединений общей формулы (Fe₃O₄⁺)m⋅(C₆H₇O₇^-)n за 5-10 мин до КМРТ сканирования исследуемой области с последующей визуализацией контрастного изображения границы диффузной инфильтрации ЗК в нормальные ткани;

- проведение КМРТ сканирования тканей в режимах получения T₁ В {600/15 [время повторения, мс/время эхо, мс], Т₂ В (1950/85) спин эхо, Т₂ В градиент эхо (600/13) и Т*₂ В градиент эхо (550/15)};

- выявление центров злокачественной пролиферации с питающими сосудами и границ диффузной инфильтрации злокачественных клеток в нормальные ткани по изменениям интенсивностей вокселей в исследуемой области.

При этом, внутривенное введение лабораторным животным водного золя соединений общей формулы (Fe₃O₄⁺)m⋅(C₆H₇O₇^-)n проводят из расчета 0,2-5,0 мл/кг за 50 мин 12 ч до КМРТ сканирования исследуемой области, а внутривенное введение лабораторным животным магневиста® проводят из расчета 0,2-1,5 мл/кг.

Таким образом, заявляется средство на основе водного золя ферримагнитных наночастиц цитратферрита (ФНЦФ) общей формулы (Fe₃O₄⁺)m⋅(C₆H₇O₇^-)n, где: m от 14% масс до 29% масс и n от 71% масс до 86% масс, предпочтительно m от 16% масс до 27% масс и n от 73% масс до 84% масс. При этом с увеличением массы m увеличивается гидрофобность ФНЦФ, уменьшается растворимость в воде и увеличивается острая токсичность, а с увеличением массы n увеличивается их гидрофильность, увеличивается растворимость в воде и уменьшается острая токсичность.

Краткое описание чертежей

Изобретение поясняется чертежами и таблицами.

Фигура 1 (а, b, с, d, е, f, g, h, i, j, k, l, m, n, p, q, r, s, t, u, v, w). Ранние контрастные MPT изображения (РКМРТИ) патологических изменений в динамике на месте перевивки солидных злокачественных опухолей глиомы (Г) С6 и глиобластомы (ГБ) 101/8, визуализируют в виде срезов первичных центров злокачественной пролиферации (ПЦЗП)

после ВВ введения комбинации ферримагнитных наночастиц цитратферрита (ФНЦФ) и магневиста®.

Фигура 1 (а, b, с, d, е, f, g, h) Ранние РКМРТИ патологических изменений в динамике на месте перевивки Г С6 визуализируют в виде срезов ПЦЗП после ВВ введения комбинации ФНЦФ 28 и магневиста®:

1 (а) через 24-30 ч после перевивки бесформенные РКМРТИ или точки и пятна;

1 (b) через 48-72 ч после перевивки РКМРТИ первичного центра злокачественной пролиферации (ПЦЗП) (большие черные стрелки), который частично покрыт участками формирующейся мембраны, (толстые белые стрелки), малигнизированные сосуды (маленькие белые стрелки), 1 стадия развития ПЦЗП;

1 (с) через 72-96 ч после перевивки РКМРТИ ПЦЗП (между черными стрелками) и малигнизированные сосуды, питающие ПЦЗП, (между белыми стрелками), 2 стадия развития ПЦЗП;

1 (d) через 96-120 ч, после перевивки РКМРТИ ПЦЗП (между черными стрелками), изолированного формирующейся многослойной мембраной ПЦЗП (белые стрелки), 3 стадия развития ПЦЗП;

1 (е) через 120-144 ч после перевивки РКМРТИ ПЦЗП, (между тонкими черными стрелками), однослойную мембрану ПЦЗП (между черной и белой стрелками), 4 стадия развития ПЦЗП;

1 (f) через 144-168 ч перфорацию мембраны с проникновением ФНЦФ 28 в ПЦЗП, (между черными стрелками), формирование вторичных ЦЗП (ВЦЗП), генерирующих гиперинтенсивные сигналы протонов, (белые стрелки), 5 стадия развития ПЦЗП;

1 (g) через 168-192 ч визуализируют дефрагментацию мембраны ПЦЗП (между двумя длинными, толстыми белыми стрелками), формирование вторичных ЦЗП (ВЦЗП) (между двумя короткими белыми стрелками), инвазию злокачественных клеток в кровеносный сосуд (белая стрелка), сформировавшиеся ВЦЗП (между тонкими белыми стрелками), малигнизированные сосуды (тонкие белые пунктирные стрелки), ткани, насыщенные ФНЦФ, (белые, толстые пунктирные стрелки), 6 стадия - дефрагментация мембраны ЦЗП;

1 (h) через 192-216 ч - инвазию клеток Г С6 из кровеносного сосуда правой половины мозга в здоровые ткани левой половины мозга с их малигнизацией и неоангиогенезом (длинная белая стрелка); извитые малигнизированные сосуды (короткие стрелки); вторичный ЦЗП (между двумя стрелками).

1 (i, j, k, l). Ранние контрастные MPT изображения (РКМРТИ) патологических

изменений в динамике в головном мозге крысы, на месте перевивки солидной злокачественной опухоли ГС6, после ВВ введения комбинации ферримагнитных наночастиц цитратферрита и магневиста® визуализируют срезы головного мозга крысы Вистар:

1 (i) через 120-144 ч, на 4 стадии развития ПЦЗП, до введения ФНЦФ 28 из-за недостатка черных вокселей мембрана капсулы ПЦЗП и границы диффузной инфильтрации не видны (стрелка);

1 (j) через 120-144 ч, на 4 стадии развития ПЦЗП, после введения в хвостовую вену 0,2 мл 5% ФНЦФ 28 визуализируют мембрану капсулы, расположенную по периферии ПЦЗП, (маленькая стрелка) см. также фигуру 13;

1 (k) через 144-168 ч, на 5 стадии развития ПЦЗП, визуализируют контрастную границу диффузной инфильтрации (длинная стрелка), узкая светлая полоса, расположенная по границе мембраны ПЦЗП и нормальных тканей мозга (ограниченная диффузная инфильтрация пролиферирующих клеток НГС6 в нормальные ткани мозга через «щели» в мембране ПЦЗП) подтверждением полученных результатов служит фигура 13;

1 (l) через 168-192 ч, на 6 стадии развития ПЦЗП - инвазию и диффузную инфильтрацию мембраны ПЦЗП (короткая стрелка) широкую светлую полосу, образовавшуюся в результате инвазии и диффузной инфильтрации пролиферирующих клеток С6 в нормальные ткани мозга (длинная стрелка); мембрана (маленькая стрелка).

1 (m, n, р, q, r). Граница диффузной инфильтрации в динамике (пунктирные стрелки):

1 (m) через 96-120 ч, после перевивки - КМРТИ первичного ЦЗП (тонкая белая стрелка), разрушение мембраны ПЦЗП (черная стрелка), с проникновением ФНЦФ 28 в ПЦЗП, 5 стадия развития ПЦЗП;

1 (n) через 120-144 ч после перевивки раннее КМРТИ ПЦЗП, (тонкая черная стрелка), разрушение мембраны ПЦЗП (черная стрелка), 6 стадия развития ПЦЗП;

1 (р) через 144-168 ч после перевивки раннее КМРТИ ПЦЗП, (тонкая черная стрелка), разрушение мембраны ПЦЗП (черная стрелка), 6 стадия развития ПЦЗП;

1 (q) через 168-192 ч - фрагментацию мембраны ПЦЗП (маленькая, черная стрелка), 6 стадия развития ПЦЗП;

1 (r) через 336-400 ч на месте первичного ЦЗП НГБ 101/8 (пунктирная стрелка) образовалась полицентрическая опухоль, включающая 6 вторичных- и 2 третичных ЦЗП с несколькими инвазиями в «нормальные» ткани мозга, (маленькая стрелка), 7 стадия развития ПЦЗП.

Фигура 2. 1 стадия развития ПЦЗП карциномы легких Льюис (LLC). На 2-4 день после

перевивки LLC в мышцу бедра самки мыши C57Bl/6j визуализируют: КМРТ изображение ПЦЗП размером до 4 мм с сосудом, питающим ПЦЗП (стрелка); слой клеток мембраны богатый ФНЦФ 28 (между стрелками), образующими темные пятна и полосы с гипоинтенсивными МРТ сигналами протонов.

Фигура 3 (а, b). 5 стадия. Визуализируют: контрастное МРТ изображение ПЦЗП LLC. Через 5-7 дней объем ПЦЗП увеличился от 9 до 12 раз: (а) малигнизированные сосуды, снабжающие ПЦЗП, (между белой и черной стрелками); (b) ПЦЗП (между белыми стрелками), ткани, содержащие ФНЦФ, проникшие в ПЦЗП в результате перфорации мембраны, (между черными стрелками), светлые полосы и точки - инфильтрация пролиферирующих злокачественных клеток в кровеносную систему и в нормальные ткани (между белой и черной стрелками).

Фигура 4 (а, b, с). Режим «Ангио». Через 4-7 дней после перевивки LLC в мышцу бедра мыши визуализируют: контрастные МРТ изображения сосудов, питающих ПЦЗП, (а) 2 стадия, сеть злокачественных сосудов и капилляров, питающих опухоль и несколько небольших ПЦЗП (между стрелками); (b) 5 стадия, расширенные малигнизированные сосуды, питающие центры злокачественной пролиферации, (между пунктирными стрелками); (с) 6 стадия, светлые полосы, выходящие из опухоли, инвазия злокачественных тяжей и клеток в нормальные ткани (между черными и белыми пунктирными стрелками).

Фигура 5 (а, b, с, d, е, f). Контрастные МРТ изображения развития ПЦЗП через 5-14 дней после перевивки LLC в мышцу правого бедра, визуализируют: (а) 4 стадия, инфильтрирующего ПЦЗП, малигнизация и отек тканей, граничащих с ПЦЗП (стрелки);

(b) инфильтрирующий ПЦЗП на 5 стадии развития, отек и малигнизация пограничных тканей и сосудов, неоангиогенез сосудов, питающих ПЦЗП (стрелки); (с) 5 стадия, инфильтрирующего ПЦЗП (пунктирная стрелка), инвазия из центров злокачественной пролиферации (маленькие тонкие стрелки), множественные инвазии (маленькие толстые стрелки); (d) 6 стадия, ПЦЗП инфильтрирует в брюшную полость и образует вторичный центр злокачественной пролиферации, который смещает переполненный мочевой пузырь;

(е) 6 стадия, гидроцефалия, инвазия первого злокачественного жгута в ткани начинается из ПЦЗП (между черной и белой стрелками) и заканчивается образованием метастазов в переполненном мочевом пузыре (тонкие черные стрелки), инвазия второго злокачественного жгута в нормальные ткани начинается из вторичного ЦЗП позвоночника (между двумя черными стрелками), в нормальных тканях, жгут распускается, клетки инфильтрируют в нормальные ткани с образованием третичных центров злокачественной

пролиферации (ТЦЗП) в печени и легких (между двумя белыми стрелками); (f) негатив.

Фигура 6 (а, b, с, d). Центр злокачественной пролиферации аденокарциномы Са 755: (а) сосуд, питающий ЦЗП (белые стрелки); (b) мембрана ЦЗП (черная стрелка), инвазия ЗК с проникновением ФНЦФ 28 в ЦЗП (белые стрелки); (с) инвазия ЗК с проникновением ФНЦФ 28 в ЦЗП (белые стрелки); (d) инвазия ЗК из ЦЗП с проникновением ФНЦФ 28 в ЦЗП (белые стрелки).

Фигура 7 (а, b, с, d, е, f, g, h, i, j, k, l). Развитие ПЦЗП трубчатой и лобулярной форм аденокарциномы молочной железы Са 755, визуализируют: (а) 1 стадия, развитие первичного центра злокачественной пролиферации на месте перевивки трубчатой формы; (b) 2 стадия, развитие злокачественных трубочек; (с) 3 стадия, развитие мембраны ПЦЗП (стрелка); (d) 4 стадия, развитие опухолевых тканей, растягивающих мембрану ПЦЗП, (белая стрелка), перфорация мембраны ПЦЗП, инвазия с образованием вторичных центров злокачественной пролиферации (ВЦЗП) (черная стрелка); (е) 5 стадия, увеличение объема опухолевых тканей, перфорация мембраны и проникновение ФНЦФ 28 ПЦЗП с образованием вторичных ЦЗП (черная стрелка); (f) 6 стадия, увеличение объема вторичных ЦЗП (черные стрелки); (g) 1 стадия, развитие первичного центра злокачественной пролиферации на месте перевивки лобулярной формы опухоли Са 755 (стрелка); (h) 2 стадия, развитие злокачественных лобулярных тканей (стрелка); (i) 3 стадия, развитие мембраны ПЦЗП и увеличение массы опухолевых тканей (между стрелками); (j) 4 стадия, развитие опухолевых тканей, растягивающих мембрану ПЦЗП, (между стрелками), перфорация мембраны ПЦЗП, инвазия с образованием вторичных центров злокачественной пролиферации (между стрелками); (k) 5 стадия, увеличение объема опухолевых тканей, перфорация мембраны ПЦЗП с образованием вторичных ЦЗП (ВЦЗП) (между стрелками); (l) 6 стадия, увеличение объема вторичной опухоли с перфорацией мембраны (между стрелками).

Фигура 8 (а, b, с, d). Контрастное МРТ изображение развития ПЦЗП лобулярной формы аденокарциномы молочной железы Са 755, визуализируют: (а) 6 стадия, образование множественных вторичных центров злокачественной пролиферации (толстые стрелки) с инвазией клеток Са 755 в лимфатическую систему и другие нормальные ткани (тонкие стрелки); (b) негатив; (с) 6 стадия, инвазия спонтанной злокачественной опухоли молочной железы в печень и другие внутренние органы у крысы Линии Wistar (белая стрелка); (d) инвазия опухоли в печень, легкое и другие органы (белые стрелки).

Фигура 9 (а, b). 6 стадия. Контрастные МРТ изображения ВЦЗП лимфатической системы, пораженной клетками лимфолейкоза Р388 у самки мыши DBA 2, через 48 ч после

внутрибрюшинного введения 10⁶ клеток лимфолейкоза Р388 визуализируют: (а) метастазирование клеток лимфолейкоза Р388 в области подмышечных лимфатических узлов с образованием вторичных ЦЗП (стрелки); (b) лимфатические узлы, пораженные лимфолейкозом Р388 (стрелки).

Фигура 10 (а, b, с, d, е, f, g, h). КМРТ изображения меланомы B16F-11:

(а) патологические изменения поверхности кожи ПЦЗП в подмышечной области, на месте подкожной инокуляции 10⁶ злокачественных клеток (между черными стрелками), отек сосудов, питающих ПЦЗП, (между пунктирными стрелками); псевдостручек диссеминирующий поверхность кожи, струйки клеток B16F-11, мигрирующих от псевдостручка по поверхности клеток кожи, (тонкие стрелки); (b) первичный ЦЗП меланомы B16F-11 (черная стрелка); инвазионные стромальные трубки (между белыми стрелками); псевдостручек с клетками меланомы B16F-11, диссеминирует внутренние органы опухолевыми клетками (белая стрелка); (с) режим «Ангио», меланома B16F-11, расположенная под кожей правой подмышечной области самки мыши C57Bl/6j, патологические изменения сосудистой системы мыши под действием клеток и белков меланомы B16F-11 (между стрелками); (d) первичный центр злокачественной пролиферации меланомы B16F-11 (длинная стрелка); инвазия в аорту, грудину и печень (короткие стрелки); (е) режим «Ангио», часть мембраны ПЦЗП (белая стрелка), первичный центр злокачественной пролиферации (черная стрелка), патологические изменения кровеносной системы и внутренних органов (между белыми стрелками); (f) первичный ЦЗП меланомы B16F-11 покрыт перфорированной мембраной ПЦЗП, содержит ФНЦФ 28 и имеет черный цвет (между тонкими белыми стрелками), вторичные ЦЗП, покрытые нативными мембранами, не содержат ФНЦФ 28 и имеют белый цвет (большие белые стрелки), сосудистая система опухоли (маленькие белые и черные стрелки); (g) инвазия опухоли и неоангиогенез в печени, расширенные и деформированные злокачественной пролиферацией кровеносные малигнизированные сосуды (маленькие белые стрелки), ПЦЗП (большая белая стрелка); (h) зрелый ПЦЗП, содержащий некротизированные участки серого цвета (короткая белая стрелка), ПЦЗП конец черной стрелки, место выхода инвазионной стромальной трубки из мемраны ПЦЗП (длинная белая стрелка), инвазионная стромальная трубка (конец белой стрелки), вторичный ЦЗП, образовавшийся в головке инвазионной стромальной трубки (маленькая черная стрелка).

Фигура 11 (а, b, с, d, е). 6 стадия. Контрастные магнитно-резонансные томографические изображения развития меланомы B16F-11, привитой под кожу правой

подмышечной области самки мыши C57Bl/6j:

11 (а) стромальная инвазивная эндотелиальная трубка меланомы B16F-11, в которой развиваются, и с помощью которой распространяются в организме млекопитающих ЦЗП B16F-11 (белая стрелка), некротизированные ткани ПЦЗП меланомы B16F-11 (черная стрелка), малигнизированные сосуды, питающие стромальную трубку меланомы B16F-11, (большая белая стрелка), первичный ЦЗП, конец трубки, в котором происходит развитие вторичного ЦЗП;

11 (b) аналогичное развитие стромальной инвазивной эндотелиальной трубки меланомы B16F-11 (5 стадия).

11 (с) 6 стадия, малигнизированные сосуды головного мозга мыши, питающие метастазы меланомы B16F-11, (длинные белые стрелки), метастазы меланомы B16F-11 в головном мозге мыши (короткие белые стрелки), стромальная эндотелиальная трубка меланомы B16F-11 с ПЦЗП (черная стрелка), (d) негатив, (е) 6 стадия, вторичные ЦЗП (черные стрелки), инвазия опухоли B16F-11 из вторичных ЦЗП (белые стрелки), струйки клеток B16F-11, вытекающие из псевдостручка и диссеминирующие здоровые ткани мыши (концы тонких белых стрелок).

Фигура 12 (а, b). (а) 6 стадия. Цифровая фотография крысы Линии Wistar с аденокарциномой молочной железы под вторым правым, соском. Железа увеличилась в размерах на 2 прядка и вызвала патологические изменения состава крови, инвазию в печень и легкие, см. фигура 8 (с, d); (b) цифровая фотография, препарат самки мыши C57Bl/6j с патоморфологически измененными внутренними органами при меланоме B16F-11, первичная опухоль в правой подмышечной области (между тремя маленькими стрелками); метастазирование с образованием вторичной опухоли меланомы B16F-11 на месте левой почки (длинная стрелка); крупный метастаз меланомы B16F-11 в правой почке (короткая стрелка).

Фигура 13 (а, b, с). Гистологический анализ тканей головного мозга, занятых мембраной ПЦЗП включает:

- (а) участок первичного центра злокачественной пролиферации, в котором преимущественно содержатся злокачественные клетки Г С6, находящиеся в состоянии митоза;

- (b) мембрану, состоящую из макрофагов, лимфоцитов, лейкоцитов и других иммунокомпетентных клеток (ИКК), инфильтрированную злокачественными клетками Г С6, и «изолирующую» участок, занятый ПЦЗП от нормального мозга;

- (с) пограничные мембране ПЦЗП ткани мозга, содержащие много макрофагов, лимфоцитов, лейкоцитов и небольшое число клеток ЗГ Сб.

На изображениях гистологических срезов четко не очерчены границы между первичным центром злокачественной пролиферации, мембраной и пограничными тканями мозга, инфильтрированными злокачественными клетками, наблюдаются: цельные клетки ЗГ С6 и их срезы с ядром в центре, покрытые ферримагнитными наночастицами цитратферрита и макрофаги. Злокачественные клетки, покрытые наночастицами, окрашены по Перлсу, имеют темно-синюю окраску, округлую форму, ядро и мигрируют из первичного центра злокачественной пролиферации (ПЦЗП) в нормальные ткани мозга (черные пунктирные стрелки). Макрофаги, крупные светло-синие клетки, непредсказуемой формы, составляющие от 70 до 90% клеток в структуре мембраны ПЦЗП, мигрируют в сторону ПЦЗП (белые стрелки). Макрофаги эндоцитируют, дефрагментируют и убивают попадающиеся им злокачественные клетки, (черные пунктирные стрелки). Макрофаги, переполненные фрагментами злокачественных клеток, уменьшаются в размерах, истончаются и постепенно исчезают в среде клеток ГБ. В ПЦЗП макрофаги практически отсутствуют. Окраска по Перлсу, Х300.

Фигура 14. Гистологический анализ тканей участка мембраны первичного центра злокачественной пролиферации (ПЦЗП) глиобластомы 101/8 (ГБ), находящегося в мозге крысы линии Wistar. Ткани мембраны богаты жизнеспособными злокачественными клетками, макрофагами, лейкоцитами, лимфоцитами: макрофаги, эндоцитируют и дефрагментируют опухолевые клетки, (пунктирные стрелки); дефрагментированные опухолевые клетки (короткие белые стрелки). Окраска по Перлсу, X1000.

Формула изобретения

1. Средство для раннего контрастного магнитно-резонансного томографического выявления центров злокачественной пролиферации и определение стадий их развития in vivo в динамике, включающее водный золь ферримагнитных наночастиц цитратферрита общей формулы (Fe₃O₄⁺)_m⋅(C₆H₇O₇^-)_n, где:

- нанокристаллы Fe₃O₄ содержат от (1,01Fe²⁺O⋅1,99Fe³⁺₂O₃) до (1,30Fe²⁺O⋅1,70Fe³⁺₂O₃), при этом m - количественное содержание нанокристаллов формулы Fe₃O₄ в составе ферримагнитных наночастиц цитратферрита составляет от 14 масс. % до 29 масс. %, а n - количественное содержание цитратанионов формулы (С₆Н₇О₇^-) от 86 масс. % до 71 масс. %;

- цитратанионы (С₆Н₇О₇^-)_n связаны с поверхностью нанокристаллов (Fe₃O₄⁺)_m химически и содержатся в поверхностном слое ферримагнитных наночастиц, (Fe₃O₄⁺)m⋅(C₆H₇O₇^-)n;

- количество наночастиц (Fe₃O₄⁺)m⋅(C₆H₇O₇^-)n в водном золе составляет от 0,01 до 50 масс. %;

- гидродинамический диаметр наночастиц (Fe₃O₄⁺)m⋅(C₆H₇O₇^-)n составляет от 9 до 130 нм;

- намагниченность насыщения наночастиц (M_s) составляет от 8,3 кА/м до 8,9 кА/м;

- рН водного золя от 6,6 до 6,9;

- ζ потенциал водного золя -31±5 мВ;

- релаксивность водного золя 4550±25 мл⋅мг^-1с^-.

2. Средство по п. 1, характеризующееся тем, что m - количественное содержание (Fe₃O₄)⁺ в составе ферримагнитных наночастиц цитратферрита составляет от 16 масс. % до 27 масс. %, n (С₆Н₇О₇)^- - от 84 масс. % до 73 масс. %.

3. Способ получения средства по п. 1, включающий:

- синтез ферримагнитных нанокристаллов нестехиометрического магнетита, содержащего Fe²⁺O и Fe³⁺₂O₃ в соотношении от 1,01/1,99 до 1,30/1,70, характеризующегося структурой шпинели, кубической формой, общей формулы Fe₃O₄;

- травление полученных ферримагнитных нанокристаллов 36% хлористоводородной кислотой от 2 до 10 ч с получением водного золя нанокристаллов общей формулы от (1,05Fe²⁺O⋅1,85Fe³⁺₂O₃⋅0,1Fe³⁺OCl)_m до (1,15Fe²⁺O⋅1,75Fe³⁺₂O₃⋅0,1Fe³⁺OCl)_m,

при этом количественное содержание в водном золе нанокристаллов соединения формулы (1,05Fe²⁺O⋅1,85Fe³⁺₂O₃⋅0,1Fe³⁺OCl) составляет от 10 масс. % до 40 масс. %, характеризующихся структурой шпинели, округлой формой, диаметром от 5 до 11 нм, и наличием на поверхности анионов Cl^-;

- покрытие полученных нанокристаллов в водном золе цитратанионами посредством замещения анионов Cl^- на цитратанионы, при этом реакцию замещения ведут при +80-+90°С и перемешивании от 300 до 1500 об/мин, при рН от 3,5 до 6,9 до образования водного золя соединений общей формулы (Fe₃O₄⁺)m⋅(C₆H₇O₇^-)n.

4. Способ по п. 3, характеризующийся тем, что ферримагнитные нанокристаллы цитратферрита содержат на поверхности цитрат анионы (С₆Н₇О₇)^-_n.

5. Способ по п. 3, характеризующийся тем, что реакцию замещения анионов Cl^- на цитратанионы ведут при перемешивании от 500 до 1000 об/мин.

6. Способ контрастного магнитно-резонансного томографического выявления центров злокачественной пролиферации с питающими сосудами и расширяющейся границей диффузной инфильтрации злокачественных клеток в нормальные ткани в эксперименте, включающий:

- внутривенное введение лабораторным животным от 0,1 до 10 мл/кг, предпочтительно от 0,2 до 5,0 мл/кг, от 2% до 5% водного золя соединений общей формулы (Fe₃O₄⁺)m⋅(С₆Н₇О₇^-)n за 10 мин - 75 ч до КМРТ сканирования исследуемой области и первичное внутривенное введение от 0,1 до 2,0 мл/кг магневиста® за 3-9 мин до КМРТ сканирования, которые вызывают раннюю КМРТ визуализацию развития центров злокачественной пролиферации с питающими сосудами, расширяющейся границей диффузной инфильтрации злокачественных клеток в нормальные ткани в течение 75 ч с перерывами;

- проведение КМРТ сканирования тканей в режимах получения T₁ В {600/15 [время повторения, мс/время эхо, мс], Т₂ В (1950/85) спин эхо, Т₂ В градиент эхо (600/13) и Т*₂ В градиент эхо (550/15)};

- повторное внутривенное введение от 0,1 до 0,2 мл/кг магневиста® за 3-5 мин до КМРТ сканирование исследуемой области, с визуализацией границ диффузной инфильтрации ЗК в нормальные ткани и вторичное внутривенное введение от 0,1 до 1,0 мл/кг, от 2% до 5% водного золя соединений общей формулы (Fe₃O₄⁺)m⋅(C₆H₇O₇^-)n за 5-10 мин до КМРТ сканирования исследуемой области с последующей визуализацией контрастного изображения границы диффузной инфильтрации ЗК в нормальные ткани;

- проведение КМРТ сканирования тканей в режимах получения T₁ В {600/15 [время повторения, мс/время эхо, мс], Т₂ В (1950/85) спин эхо, Т₂ В градиент эхо (600/13) и Т*₂ В градиент эхо (550/15)};

- выявление центров злокачественной пролиферации с питающими сосудами и границ диффузной инфильтрации злокачественных клеток в нормальные ткани по изменениям интенсивностей вокселей в исследуемой области.

7. Способ по п. 6, характеризующийся тем, что первичное внутривенное введение лабораторным животным водного золя соединений общей формулы (Fe₃O₄⁺)m⋅(С₆Н₇О₇^-)n проводят из расчета 0,2-5,0 мл/кг.

8. Способ по п. 6, характеризующийся тем, что первичное внутривенное введение лабораторным животным во

Изобретение "СРЕДСТВО ДЛЯ РАННЕГО КОНТРАСТНОГО МРТ ВЫЯВЛЕНИЯ ЦЕНТРОВ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОЙ ПРОЛИФЕРАЦИИ С ПИТАЮЩИМИ СОСУДАМИ, ГРАНИЦАМИ ДИФФУЗНОЙ ИНФИЛЬТРАЦИИ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТАДИЙ ИХ РАЗВИТИЯ В ДИНАМИКЕ" (Брусенцов Николай Антонович, Голубева Ирина Сергеевна, Борисова Лариса Михайловна, Бочарова Ольга Алексеевна , Пирогов Юрий Андреевич, Анисимов Николай Викторович, Гуляев Михаил Владимирович ) отмечено юбилейной наградой (25 лет Российской Академии Естествознания)
Медаль Альфреда Нобеля

Оформление наградных документов и заказ каталога