Способ использования маркерных белков сапробных групп индикаторных организмов для оценки экологического состояния окружающей среды

Название	Способ использования маркерных белков сапробных групп индикаторных организмов для оценки экологического состояния окружающей среды
Разработчик (Авторы)	Фролова Людмила Леонидовна, Хусаинов Артур Маратович, Свердруп Антоний Элиас
Вид объекта патентного права	Изобретение
Регистрационный номер	2702852
Дата регистрации	11.10.2019
Правообладатель	федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Казанский (Приволжский) федеральный университет" (ФГАОУ ВО КФУ)
Область применения (класс МПК)	C12Q 1/02 (2006.01) C12N 1/00 (2006.01)

Описание изобретения

Изобретение относится в целом к области биологии, преимущественно к области экологического мониторинга, более точно к способам оценки экологического состояния окружающей среды посредством использования маркерных белков сапробных групп индикаторных организмов, выделяемых из пробы.

Далее в тексте заявителем использованы термины, которые необходимы для облегчения однозначного понимания сущности заявленных материалов и исключения противоречий и/или спорных трактовок при выполнении экспертизы.

Антиген — любое вещество, которое, поступая в организм парентеральным путем, вызывает ответную специфическую иммунологическую реакцию, проявляющуюся в образовании специфических антител [1].

Биоиндикация — оценка качества природной среды по состоянию её биоты. Биоиндикация основана на наблюдении за составом и численностью видов-индикаторов индикаторных организмов — биоиндикаторов.

Индикаторные организмы (биоиндикаторы) — виды, группы видов или сообщества, по наличию, степени развития, изменению морфологических, структурно-функциональных, генетических характеристик которых судят о качестве воды и состоянии экосистем [2].

Сапробность — комплекс физиолого-биохимических свойств организма, обусловливающий его способность обитать в воде с тем или иным содержанием органических веществ, то есть с той или иной степенью загрязнения [3].

Для оценки степени загрязнения водоемов органическими веществами установлены пять зон загрязнения: поли-, a-мезо, b-мезо, олигосапробную и ксеносапробную [4].

Сапробионты разделены на три группы:

- Организмы собственно сточных вод — полисапробионты (p-сапробы);

- Организмы сильно загрязненных вод — мезосапробионты (две подгруппы — α-мезосапробы и β-мезосапробы);

- Организмы слабозагрязненных вод — олигосапробы (o-сапробы)

- Организмы чистых вод – ксеносапробы (х-сапробы).

Биота — исторически сложившаяся совокупность видов живых организмов, объединённых общей областью распространения в настоящее время или в прошедшие геологические эпохи [5].

Гидробионты – организмы, постоянно обитающие в водной среде. [6].

Организм - это живое тело, обладающее совокупностью свойств, отличающих его от неживой материи, в том числе обменом веществ, самоподдерживанием своего строения и организации, способностью воспроизводить их при размножении, сохраняя наследственные признаки [7].

Зоопланктон - водные животные, которые не могут противостоять течениям и пассивно переносятся вместе с водными массами [8].

Зообентос — включает в себя организмы, относящиеся к разным систематическим группам — членистоногим, моллюскам, червям [9].

Фитопланктон – совокупность свободно дрейфующих в толще воды морских и континентальных водоёмов организмов, которые могут осуществлять процесс фотосинтеза; фитопланктон является первичным продуцентом органического вещества в водоёме и служит пищей для зоопланктона и зообентоса [10].

По мнению заявителя, следует обратить внимание на следующие описанные выше понятия, имеющие существенное значение для заявленного технического решения - индикаторные организмы и сапробность. Указанные понятия имеют различный смысл и различное назначение: сапробность - это способность организма обитать в воде с тем или иным содержанием органических веществ, то есть с той или иной степенью загрязнения, а индикаторные организмы характеризуют качество воды и экосистем и могут существовать только в одной (или переходной) зоне сапробности.

Результативность природоохранных мер зависит от своевременного получения достоверных данных экологического мониторинга, используемых для оценки и диагностики экологического состояния окружающей среды.

Как известно, оценку экологического состояния окружающей среды выполняют различными способами с использованием различных методов, например физических, химических, биологических с использованием различных репрезентативных показателей среды. Одним из высокоинформативных способов оценки экологической обстановки является способ биоиндикации, то есть выявление реакции живых организмов на изменение условий среды их обитания, например – загрязнение или очищение среды обитания [11].

Из исследованного уровня техники заявителем выявлен источник [Sladechek V. System of water quality from the biological point of view (Система оценки качества воды...) Arch. Hydrobiol. Ergeb. Limnol, 1973. – Р.179-191] [12]. Краткой сущностью известного технического решения является сопоставление видов в пробе со списком индикаторных видов и присвоение видам в пробе индикаторной значимости. Способ предполагает идентификацию гидробионтов в пробе по морфологическим (внешним) признакам, например, конфигурации организма, окрасу и т.д., визуально с использованием микроскопа путем выполняемых вручную манипуляций, как то - извлечение организма из пробы в целом состоянии и его визуальная идентификация. Оценку экологического состояния окружающей среды выполняют на основе изучения обитающих в исследуемой среде гидробионтов (видов-индикаторов).

Недостатком известного технического решения является высокая трудоемкость и сложность определения видов-индикаторов с одновременным использованием оптических приборов, справочников-определителей, необходимость привлечения специалистов высокой квалификации, что не позволяет с высокой эффективностью использовать его (известный способ) по назначению.

Из исследованного уровня техники заявителем выявлен источник [Определитель пресноводных беспозвоночных России и сопредельных территорий/ под ред. С.Я. Цалолихина. – СПб.: Изд. «Наука», 1994. – 394 с.] [13]. Сущностью известного технического решения является способ идентификации вида-индикатора на основе выявления и анализа морфологических признаков индикаторного организма, идея способа идентична аналогу [12], приведенному выше.

Недостатками известного способа являются существенная времязатратность осуществления идентификации вида-индикатора и зависимость результатов оценки по морфологическим признакам от квалификации и субъективности эксперта. Кроме того, известный способ обладает недостаточной разрешающей способностью и достоверностью результатов из-за существования видов-двойников, имеющих схожее внешнее строение и существующего в природе гетероморфного жизненного цикла некоторых живых организмов, то есть происходящего в течение жизни изменения внешнего вида определяемого организма.

Из исследованного уровня техники заявителем выявлен источник [Иммуноферментный анализ (ИФА, ELISA). Суть, принцип метода и этапы исследования. Анализ на антитела, классы антител, иммунный комплекс. http://www.polismed.com/articles-immunofermentnyjj-analiz-ifa-elisa-sut-princip-metoda-i-ehtapy-issledovanija.html] [14]. Сущностью известного технического решения является метод иммуноферментного анализа (ИФА), который используют для определения наличия антигенов возбудителей различных инфекций в растениях, животных, человеке и других материалах путем выявления свойственных этим возбудителям уникальных антигенов к маркерным белкам.

Известное техническое решение использовано заявителем для получения количества белка сапробных групп индикаторных организмов.

Из исследованного уровня техники заявителем выявлен патент на изобретение WO9946401 «Use of 14-3-3 proteins as sensitive biological markers for detecting pollution caused, inter alia, by polychlorinated biphenyl (PCB) and (xeno)oestrogen and method for quick determination of 14-3-3 proteins» [15] («Использование белков 14-3-3 в качестве чувствительных биологических маркеров для обнаружения загрязнения, вызванного, среди прочего, полихлорированным бифенилом (ПХБ) и (ксено) эстрогеном и методом быстрого определения белков 14-3-3»). Сущностью известного технического решения является способ обнаружения природных и антропогенных экологических химических веществ, в частности полихлорированных бифенилов и / или (ксено) эстрогенов в водоемах или в почве, характеризующийся тем, что 14-3-3 белков в качестве биомаркеров в биоиндикаторных организмах (позвоночных и беспозвоночных), соответствующая той, которая должна быть исследована, подвергаться воздействию воды или почвы. Способ определения и определения концентрации белка(ов) 14-3-3 (= ELISA), отличающийся тем, что микротитрационные планшеты используются для специфического связывания (и концентрации) белков 14-3-3 с пептид, имеющий связывающий мотив покрытого белком 14-3-3. Например, можно использовать активированные малеимидом микротитрационные планшеты, к которым химически синтезированный пептид CAALPKINRSApSEPSLHR (pS фосфосерин), который связывается с высоким сродством с белками 14-3-3, связан реакцией сульфгидрильной группы N- концевой цистеин. После добавления экстрактов или биологических жидкостей, подлежащих исследованию, в лунки планшета для микротитрования обнаружение и количественное определение образовавшихся белковых комплексов пептида-14-3-3 происходит, например, с помощью меченых антител, таких как конъюгат с щелочной фосфатазой антитела. В качестве альтернативы можно использовать покрывающие стрептавидином микротитрационные планшеты, к которым биотинилированный пептид связывается с моментом связывания белка 14-3-3; инкубация биотинилированного пептида с образцом (образование белковых комплексов пептида 14-3-3) проводится до или после его связывания с пластиной. Предел обнаружения ELISA составляет не менее 10 нг 14-3 3 белка / мл и может быть увеличен до менее 1 нг / мл, например, путем последующего прекращения цветовой реакции. Использование метода ELISA по п.2 формулы изобретения для определения и количественного определения белка 14-3-3 у позвоночных и беспозвоночных, подвергнутых воздействию природных и антропогенных экологических химических веществ, полихлорированных бифенилов и / или (ксено) эстрогенов. Использование метода ELISA по п.2 формулы изобретения для обнаружения и количественного определения белка 14-3-3 в биологических жидкостях (например, спинномозговой жидкости и сыворотке) людей и животных, инфицированных возбудителем прионных заболеваний.

Таким образом, изобретение относится к использованию нового биологического маркера, а именно - одного или нескольких белков 14-3-3, для обнаружения антропогенной нагрузки в пресной воде, морской воде, питьевой воде или образцах почвы природных и антропогенных химических продуктов, полученных из окружающей среды, в частности, полихлорированного бифенила (ПХБ) и / или эстрогена / ксеноэстрогена [(ксено) эстрогена] и (2) нового метода (метод ELISA) для количественного и количественного измерения белков 14-3-3. Указанный метод ELISA также может быть использован для обнаружения появления белка 14-3-3 в физиологических жидкостях человека и животных, инфицированных патогенным агентом, ответственным за прионные заболевания.

Недостатком известного технического решения, в отличие от заявленного технического решения, по мнению заявителя, является то, что известный метод не нашел использования для оценки экологического состояния окружающей среды.

Наиболее близким к заявленному техническому решению, выбранным заявителем в качестве прототипа, является изобретение по патенту RU 2661739 [16] «Способ применения маркерных белков для оценки экологического состояния окружающей среды». Сущностью известного технического решения способ применения маркерных белков для оценки экологического состояния окружающей среды, включающий отбор из оцениваемой среды проб организмов с последующим анализом этих проб, отличающийся тем, что при анализе идентификацию видового состава организмов из пробы осуществляют с применением маркерных белков живых организмов, обитающих в водной среде, а оценку экологического состояния окружающей среды производят в соответствии с идентифицированным видовым составом индикаторных организмов и их соотношением в пробе, то есть иммуноферментным анализом определяют количество маркерных белков каждого из индикаторных организмов в пробе, к которым получены антитела, суммируют количество маркерных белков, содержащихся в пробе индикаторных организмов, рассчитывают частоту встречаемости индикаторных организмов в пробе путем деления количества маркерного белка каждого организма на суммарное количество маркерных белков всех организмов в пробе, последующего суммирования произведений частоты встречаемости каждого индикаторного организма на его индикаторный вес и получают суммарный индикаторный вес (СИВ) организмов в пробе, по которому оценивают экологическое состояние окружающей среды; при СИВ менее 0,5 окружающую среду оценивают предельно чистой и благополучной; при СИВ от 0,5 до 1,5 окружающую среду оценивают чистой и благополучной, не нуждающейся в выполнении природоохранных мероприятий; при СИВ от 1,5 до 2,5 окружающую среду оценивают слабозагрязненной, нуждающейся в выполнении природоохранных мероприятий по мере возможности; при СИВ от 2,5 до 3,5 окружающую среду оценивают умеренно загрязненной, нуждающейся в выполнении природоохранных мероприятий, направленных на устранение отдельных видов загрязнителей и последствий их действия; при СИВ от 3,5 и более окружающую среду оценивают грязной и неблагополучной, нуждающейся в срочном выполнении комплексных природоохранных мероприятий.

Недостатком прототипа, по сравнению с заявленным техническим решением, является наличие признака - идентификация видового состава организмов из пробы, которую (идентификацию) осуществляют с применением маркерных белков живых организмов, обитающих в водной среде.

Указанный признак, по мнению заявителя, по сравнению с заявленным техническим решением, приводит к снижению технологичности при использовании по назначению, что, как следствие, приводит к увеличению материальных затрат, трудовых затрат, временных затрат. То есть, низкая технологичность приводит к увеличению затрат, например, на индивидуальное выделение и идентификацию каждого вида индикаторного организма в пробе. При этом в заявленном техническом решении указанное действие отсутствует, заявитель проводит определение сапробных групп индикаторных организмов, что приводит к более высокой технологичности, обеспечивая повышение эффективности при его использовании по назначению. При этом формальное снижение количества признаков приводит фактически к более высокому техническому результату, что, по мнению заявителя, соответствует критерию «изобретательский уровень».

Доказательством указанного выше является детальный сопоставительный анализ прототипа с заявленным техническим решением, который приведен на Фиг. 5. Анализ Таблицы сопоставительного анализа показывает, что заявленное техническое решение совпадает с прототипом по 2 признакам – по названию и отбору проб и не совпадает по 7 признакам из 9. При этом 1 признак - идентификации видового состава организмов - имеющийся у прототипа, отсутствует в заявленном техническом решении.

В целом у заявленного технического решения по сравнению с прототипом при наличии меньшего количества признаков (8 против 9 у прототипа) достигается более высокий технический результат, так как исключена необходимость выполнения весьма трудоемкого и затратного процесса идентификации видового состава организмов.

При этом из исследованного уровне техники не выявлена технология, позволяющая достигнуть такого высокого уровня результатов – определение сапробных групп индикаторных организмов.

Заявленное техническое решение позволяет разрешить, казалось бы, неразрешимое на дату подачи заявки противоречие – определение сапробных групп индикаторных организмов, затрачивая при этом такое же количество материальных средств, сколько требуется на идентификацию одного вида организма по прототипу. При этом повышается доступность заявленного технического решения при использовании по назначению, так как обеспечивается возможность снижения (на порядок) затрат при одновременном упрощении технологичности. Так, стоимость получения одного антитела к одному белку одного индикаторного организма на рынке составляет не менее 100 тыс. руб., при этом при оценке экологического состояния водоема анализу подвергается от 10 до 100 и более организмов (в зависимости от состояния водоема). То есть, можно сделать доказательный вывод, что при применении способа по прототипу затраты составляют от 1 млн. руб. (в случае идентификации 10 видов организмов) по сравнению со 100 тыс. руб. по заявленному техническому решению (при определении 1 сапробной группы из 10 видов организмов). При этом указанный эффект достигается за счет отсутствия одного признака - идентификации видового состава организмов.

Таким образом представляется возможным сделать вывод о том, что в заявленном техническом решении достигнуто разрешение противоречия в том, что при необходимости повысить качество результатов в случаях обычного проектирования прибегают к повышению либо количества действий, либо затрат, что усложняет технологию. В заявленном же техническом решении заявителю удалось повысить качество результатов при одновременном снижении количества действий и вытекающих из этого затрат. Это подтверждает изобретательский уровень заявленного технического решения, так как не является очевидным для специалиста в данной области техники.

Основываясь на изложенном, по мнению заявителя, можно сделать вывод, что заявленное техническое решение не подпадает под действие п. 77 Правил составления, подачи и рассмотрения заявок на изобретения, то есть соответствует условию патентоспособности «изобретательский уровень», так как вместо идентификации видового состава организмов заявитель проводит определение сапробной группы индикаторных организмов, что дает превышающий суммарный технический эффект.

Таким образом, принимая во внимание выполненный выше анализ исследованного уровня техники, можно сделать доказательный вывод о том, что заявленное техническое решение не имеет аналогов по совпадающим признакам, т.к. из исследованного уровня техники не выявлены технические решения, используемые заявленную совокупность признаков, представленных в независимом пункте формулы предполагаемого изобретения в силу чего заявителем была составлена формула без ограничительной части, т.к. в заявленном техническом решении частично совпадает название и признак по отбору проб из водоёма, который является формальным, т.к. отбор проб предполагается в любом способе.

Целью заявленного технического решения является разработка нового способа использования маркерных белков сапробных групп индикаторных организмов для оценки экологического состояния окружающей среды посредством использования заявленной совокупности признаков, обеспечивающих снижение трудоёмкости работ, сокращение сроков оценки экологического состояния окружающей среды, повышение точности и достоверности результатов экологического мониторинга, оценки экологического состояния окружающей среды и природоохранных мер посредством того, что вместо идентификации видового состава организмов заявитель проводит определение сапробных групп индикаторных организмов.

Техническим результатом заявленного технического решения является способ использования маркерных белков сапробных групп индикаторных организмов для оценки экологического состояния окружающей среды, в котором (способе) вместо идентификации видового состава организмов заявитель проводит определение сапробных групп индикаторных организмов.

Заявленное техническое решение иллюстрируется Фиг.1 – Фиг.5.

На Фиг.1 приведена Таблица 1, в которой представлен суммарный индикаторный вес (СИВ) сапробных групп индикаторных зоопланктонных организмов по белку цитохром с оксидаза субъединица 1 (далее - СО1);

На Фиг.2 приведена Таблица 2, в которой представлен суммарный индикаторный вес (СИВ) сапробных групп индикаторных зообентосных организмов по белку СО1;

На Фиг.3 приведена Таблица 3, в которой представлен суммарный индикаторный вес (СИВ) сапробных групп индикаторных фитопланктонных организмов по белку хлоропластного продукта гена ribulose 1-5 bifosfaat carboxylase Large subunit (далее – rbcL).

На Фиг.4 приведена Таблица 4, в которой представлен суммарный индикаторный вес (СИВ) по белку СО1 сапробных групп индикаторных зоопланктонных организмов, отобранных из озера Малое Глубокое Республики Татарстан;

На Фиг.5 приведена Таблица сопоставительного анализа прототипа с заявленным техническим решением.

Сущностью заявленного технического решения является способ использования маркерных белков сапробных групп индикаторных организмов для оценки экологического состояния окружающей среды, заключающийся в том, что отбирают пробу организмов из оцениваемой среды, проводят анализ аминокислотных последовательностей маркерных белков индикаторных организмов на определение участков аминокислотных последовательностей маркерных белков, уникальных для каждой сапробной группы индикаторных организмов, получают антитела, специфически распознающие эти участки аминокислотных последовательностей маркерных белков, иммунно-ферментным анализом определяют количество маркерных белков каждой сапробной группы индикаторных организмов в пробе, к которой - сапробной группе - получены антитела, определяют суммарное количество маркерных белков всех сапробных групп индикаторных организмов, рассчитывают частоту встречаемости каждой сапробной группы индикаторных организмов в пробе, для чего количество маркерного белка каждой сапробной группы индикаторных организмов делят на суммарное количество маркерных белков всех сапробных групп индикаторных организмов в пробе, рассчитывают суммарный индикаторный вес (СИВ) сапробных групп индикаторных организмов в пробе, указывающий на сапробность водоема, для чего частоту встречаемости каждой сапробной группы индикаторных организмов умножают на её – сапробной группы - индикаторный вес, равный 0,1 для ксеносапробной группы, 1,0 для олигосапробной группы, 2,0 для b-мезосапробной группы, 3,0 для а-мезосапробной группы, 4,0 для полисапробной группы, полученные результаты суммируют, оценивают экологическое состояние окружающей среды - при СИВ менее 0,5 окружающую среду оценивают предельно чистой и благополучной; при СИВ от 0,5 до 1,5 окружающую среду оценивают чистой и благополучной, не нуждающейся в выполнении природоохранных мероприятий; при СИВ от 1,5 до 2,5 окружающую среду оценивают удовлетворительной чистоты, нуждающейся в выполнении природоохранных мероприятий по мере возможности; при СИВ от 2,5 до 3,5 окружающую среду оценивают загрязненной, нуждающейся в выполнении природоохранных мероприятий, направленных на устранение отдельных видов загрязнителей и последствий их действия; при СИВ от 3,5 и более окружающую среду оценивают грязной и неблагополучной, нуждающейся в срочном выполнении комплексных природоохранных мероприятий. Далее заявителем приведены предварительные пояснения к Примерам 1-5 конкретного осуществления заявленного технического решения.

Заявители ограничились Примерами с преимущественным использованием обитателей водной среды – зоопланктона, зообентоса и фитопланктона потому, что экологическое состояние находящегося на местности водоема безоговорочно, достоверно, в необходимом для восстановления нарушенного состояния окружающей среды объеме, наиболее объективно характеризует и отражает экологическое состояние окружающей водоем неводной среды – прибрежной и примыкающей к ней почвы, растительности и обитателей почвы, окружающего воздуха и обитателей воздушной и наземно-воздушной среды. Характеризует экологическое состояние окружающей водоем неводной среды потому, что водоем на местности является местом сбора атмосферных осадков (например – несущих информацию о воздушной среде дождей, снега, пыли, частиц воды в тумане), стоков талых и иных стекающих в водоем вод, опадающей листвы растений, смытых или сбитых насекомых – всех поступлений в водоем, несущих с собой (в водоем) влияющие на окружающую среду вещества. Все эти поступления (дождь, пыль, стоки, оседающий на водоем туман, талые воды и т.д.) из окружающей водоем среды сначала впитывают характеризующую отдельные составляющие окружающей среды информацию, например – в виде наличия (или отсутствия) неблагополучия среды. Затем, стекая, опадая, оседая в водоем, влияют на содержание водной среды и естественно – влияют на обитателей этой водной среды. По этой причине водоём является местом сбора и наиболее полной концентрации всей информации об окружающей водоём среде. А обитатели водоёма, например – планктонные организмы, являются наиболее удобными модельными объектами исследования, оптимальным образом и полно характеризующими экологическое состояние окружающей среды. Руководствуясь этим бесспорным фактором, заявители ограничились количеством примеров и привели в качестве Примеров использование планктонных организмов – вездесущих обитателей водоёмов.

Использование в качестве индикаторных организмов обитателей водной среды имеет информативное преимущество по сравнению с использованием обитателей других сред, которые отражают состояние только воздушной или только почвенной составляющей окружающей среды. Таким образом, использование индикаторных организмов – обитателей неводной среды менее информативно, а результаты оценки менее достоверны по сравнению с оценкой экологического состояния окружающей среды с использованием обитателей водоема. Например, использование муравьев позволяет оценить экологическое состояние преимущественно суши, использование пчёл – преимущественно экологическое состояние суши и воздушной среды. Но использованием муравьёв и пчёл невозможно оценить экологическое состояние водной составляющей окружающей природной среды. Обитатели водной среды несут наиболее полную и достоверную информацию об экологическом состоянии окружающей среды. Поэтому заявитель ограничился Примерами с использованием индикаторных организмов из приоритетной водной среды. При использовании обитателей неводных сред, например – почв, водно-воздушной и наземно-воздушной, порядок действий аналогичен действиям, описанным в Примерах 1, 2, 3, 4, 5.

При этом использование иных, кроме обитателей водоема, видов индикаторных организмов – обитателей окружающей среды, например – почвенной, воздушно-водной, воздушно – наземной сред, как в отдельности, так и в любом их сочетании также позволяет оценивать экологическое состояние окружающей среды по заявленному техническому решению, но с меньшей точностью и, как следствие, с меньшей достоверностью.

Далее заявителем приведен общий алгоритм действий, обеспечивающий возможность реализации заявленного технического решения.

Действие 1. Отбирают пробы организмов из оцениваемой водной среды известными методами.

Действие 2. Проводят анализ организмов на определение участков аминокислотных последовательностей любых маркерных белков, уникальных для сапробных групп индикаторных организмов, в результате чего получают антитела, специфически распознающие эти участки аминокислотных последовательностей маркерных белков.

Действие 3. Определяют количество (в нанограммах – нг) маркерных белков каждой сапробной группы индикаторных организмов в пробе, к которым были получены антитела известным методом иммунно-ферментного анализа (ИФА).

Действие 4. Определяют суммарный индикаторный вес (СИВ) сапробных групп индикаторных организмов.

Действие 5. Оценивают экологическое состояние окружающей среды (водоема или исследуемого объекта) по рассчитанному значению суммарного индикаторного веса сапробных групп индикаторных организмов в пробе. В соответствии с эколого-санитарной классификацией качества поверхностных вод суши по гидробиологическим показателям [17], при СИВ менее 0,5 окружающую среду оценивают предельно чистой и благополучной; при СИВ от 0,5 до 1,5 окружающую среду оценивают чистой и благополучной, не нуждающейся в выполнении природоохранных мероприятий; при СИВ от 1,5 до 2,5 окружающую среду оценивают удовлетворительной чистоты, нуждающейся в выполнении природоохранных мероприятий по мере возможности; при СИВ от 2,5 до 3,5 окружающую среду оценивают загрязненной, нуждающейся в выполнении природоохранных мероприятий, направленных на устранение отдельных видов загрязнителей и последствий их действия; при СИВ от 3,5 и более окружающую среду оценивают грязной и неблагополучной, нуждающейся в срочном выполнении комплексных природоохранных мероприятий.

Далее заявителем приведены примеры осуществления заявленного технического решения в соответствии с описанными выше Действиями.

Всего заявителем рассмотрены 5 Примеров использования маркерных белков индикаторных организмов, а именно:

- в Примере 1 рассмотрен случай оценки экологического состояния окружающей среды с использованием маркерного белка СО1 зоопланктонных индикаторных организмов.

- в Примере 2 рассмотрен случай оценки экологического состояния окружающей среды с использованием маркерного белка СО1 других (отличных от зоопланктонных организмов) индикаторных организмов – зообентосных организмов (зообентоса).

- в Примере 3 рассмотрен случай оценки экологического состояния окружающей среды с использованием другого (отличного от СО1) маркерного белка – rbcL других (отличных от зоопланктона и зообентоса) индикаторных организмов – фитопланктона.

- в Примере 4 рассмотрен случай, показывающий возможность экспериментального получения отсутствующих в базах данных аминокислотных последовательностей маркерных белков индикаторных видов организмов с целью дальнейшего пополнения международных баз данных аминокислотных последовательностей, используемых для оценки экологического состояния окружающей среды.

- в Примере 5 рассмотрен случай проведения сопоставления результатов заявленного технического решения с результатами экспертной оценки экологического состояния водоема – озера Малое Глубокое Республики Татарстан и окружающей озеро природной среды.

Пример 1. Оценка экологического состояния окружающей среды с использованием маркерного белка СО1 зоопланктонных индикаторных организмов.

Действие 1. Отбирают пробу зоопланктонных организмов из расположенного в исследуемом регионе водоема известным способом [Винберг Г.Г. Методические рекомендации по сбору и обработке материалов при гидробиологических исследованиях на пресноводных водоемах. Зоопланктон и его продукция / Ред. Г.Г. Винберг, Г.М. Лаврентьева // Л.: ГосНИОРХ, ЗИН АН СССР, 1982. – 33 с.] [18], например – с использованием марлевого сачка.

Действие 2. Проводят анализ организмов на определение участков аминокислотных последовательностей маркерных белков, уникальных для каждой сапробной группы индикаторных зоопланктонных организмов, по маркерному белку - митохондриальному белку цитохром с оксидаза субъединица 1 (СО1), для чего выполняют следующие шаги:

- Создают выборку аминокислотных последовательностей митохондриального белка цитохром с оксидаза субъединица 1 (СО1) из международной базы данных, например – TrEMBL/SwissProt на сайте UniProt (http://www.uniprot.org/), для каждой сапробной группы индикаторных зоопланктонных организмов, например – из [12] по каждой сапробности – от чистой o-, загрязнённой b -, до грязной p-;

- Осуществляют множественное выравнивание, например – с помощью программы Clustal Omega (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/), маркерных белков, например – цитохром с оксидаза субъединица 1 (СО1);

- Идентифицируют участки аминокислотных последовательностей маркерного белка СО1, уникальные для каждой сапробной группы индикаторных зоопланктонных организмов;

- Определяют индикаторный вес каждой сапробной группы индикаторных зоопланктонных организмов по [12]:

• о-сапробной группы – один участок, например – длиной 5 аминокислотных остатков (далее по тексту – а.о.), например – а.о. в позиции 31-35 (FLGDE) для о-сапробной группы индикаторных организмов родов Macrotrachela – Macrotrachela multispinosa ACI46270, Macrotrachela papillosa ABV44838 и Synchaeta – Synchaeta grandis AFD23515, Synchaeta kitina AFD23607, Synchaeta tremula ACD12432 (индикаторный вес = 1.0);

• b-мезосапробной группы – один участок, например – длиной 5 аминокислотных остатков, например – а.о. в позиции 31-35 (YLGDE) для b-мезосапробной группы индикаторных организмов родов Brachionus – Brachionus bidentatus AFQ31179, Brachionus diversicornis AFO72004, Brachionus plicatilis AAM47413 и Mytilina – Mytilina mucronata ABC02135, Mytilina ventralis macracantha AFQ31437 (индикаторный вес = 2.0);

• p-сапробной группы – один участок, например – длиной 5 аминокислотных остатков, например – а.о. в позиции 154-158 (FVWSV) для p-сапробной группы индикаторных организмов рода Chironomus – Chironomus plumosus BAR73215, Chironomus thummi AAD44526 (индикаторный вес = 4);

- Получают антитела, специфически распознающие вариабельные участки маркерного белка каждой сапробной группы индикаторных зоопланктонных организмов в пробе, например, для белка цитохром с оксидаза субъединица 1 (далее – СО1), например:

• FLGDE для о-сапробной группы индикаторных организмов родов Macrotrachela и Synchaeta;

• YLGDE для b-мезосапробной групп

Изобретение "Способ использования маркерных белков сапробных групп индикаторных организмов для оценки экологического состояния окружающей среды" (Фролова Людмила Леонидовна, Хусаинов Артур Маратович, Свердруп Антоний Элиас) отмечено юбилейной наградой (25 лет Российской Академии Естествознания)
Медаль Альфреда Нобеля

Оформление наградных документов и заказ каталога