СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИКОАГУЛЯНТНО-ФИБРИНОЛИТИЧЕСКОГО СРЕДСТВА НА ОСНОВЕ ГЕПАРИНА

Название	СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИКОАГУЛЯНТНО-ФИБРИНОЛИТИЧЕСКОГО СРЕДСТВА НА ОСНОВЕ ГЕПАРИНА
Разработчик (Авторы)	Исаев В.А., Ляпина Л.А., Оберган Т.Ю., Николаева Л.С., Семёнов А.Н., Ершов А.А.
Вид объекта патентного права	Изобретение
Регистрационный номер	2448717
Дата регистрации	20.04.2011
Правообладатель	Закрытое акционерное общество Научно-производственное предприятие "Тринита"

Описание изобретения

Изобретение относится к способу получения антикоагулянтно-фибринолитических средств на основе гепарина, которые могут быть использованы в области медицины, физиологии, биохимии, фармакологии.

Известен способ получения фибринолитического и протеолитического комплекса гепарина с ферментом трипсином, полученным в соотношении 1:6, с последующим осаждением комплекса в кислой среде (pH 2,0) и лиофильным высушиванием продукта.

Однако использование трипсина придает полученному продукту токсичные протеолитические свойства.

[Mansfeld V, Hladovec J. Studien über Reactionen des Kristallisierten Trypsins.II.Beziehung zwischen der Aktivität des Heporins und Trypsins - "Collection of Czechoslovak chemical communication", 1957, т.21, №5, c.1209].

Известен способ получения средства на основе гепарина и аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ), проявляющего антикоагулянтно-фибринолитические свойства.

Согласно способу указанный комплекс получают путем соединения водных растворов гепарина и АТФ в соотношении 1:1-20 (мол.), инкубирования при 35-37,5°С в течение 50-60 мин, а после доведения смеси фосфатным буфером до pH 3,9-4,2 добавляют 6-кратный объем охлажденного ацетона. Смесь выдерживают на холоде и после охлаждения комплекса проводят центрифугирование при 3000 g в течение 30 мин. Полученный осадок, представляющий комплекс гепарин-АТФ, лиофильно высушивают.

Известный способ имеет следующие недостатки:

- получаемый препарат можно применять только внутримышечно,

- он обладает дополнительным побочным действием за счет использования коммерческого препарата АТФ, при передозировке которого возникают брадикардия, гипотензия, бронхоспазм.

[Ляпина Л.А., Пасторова В.Е., Николаева Л.С., Изв. РАН. сер. биол. 2005. №2. С.221, "Гемостазиологическая характеристика комплекса гепарина с АТФ"].

Способ получения комплексов гепарина с аминокислотами, взятый за прототип, характеризуется следующим. Водный раствор гепарината натрия последовательно наносят на колонку с катионообменной смолой (на 15-20 мин), а затем полученный раствор выдерживают с анионно-обменной смолой (10-15 мин), после чего к полученному фильтрату при перемешивании добавляют водный раствор аминокислоты в соотношении 1:1,1, осаждают полученный комплекс органическим растворителем - спиртом или ацетоном, отделяют осадок центрифугированием, после чего его лиофильно высушивают.

Выход в расчете на исходную антикоагулянтную активность составляет от 100 до 120%. Полученное таким образом средство проявляет антикоагулянтные, антилипидемические свойства.

Однако способ получения препарата достаточно сложен, требует дорогостоящих материалов и оборудования. Кроме того, получаемые препараты нестабильны и через 17-20 дней хранения наступает потеря активности при хранении при комнатной температуре, а получаемые комплексы обладают только антикоагулянтным и незначительным антилипемическим действием. Фибринолитические и фибриндеполимеризационные свойства целевого продукта отсутствуют.

[Патент США №3577534, опубл. 1970].

Задачей изобретения является создание простого способа получения комплексного средства на основе гепарина, обладающего антикоагулянтно-фибринолитическим действием.

Поставленная задача решается способом получения антикоагулянтно-фибринолитического средства на основе высокомолекулярного гепарина, заключающимся во взаимодействии водных растворов гепарина и лейцина при перемешивании в молярном соотношении 1:3-4, образовавшийся продукт замораживают при температуре не выше -10°С и лиофильно высушивают.

Обычно перемешивание ведут в течение 25-30 мин.

Преимущественно используют 0,8-1,0% водный раствор гепарина и 0,3-1,0% раствор лейцина.

Гепарин относится к естественным антикоагулянтам прямого действия, т.е. непосредственно влияет на факторы свертывания крови (XII, XI, X, IX, VII и II). Противосвертывающее действие гепарина проявляется in vitro и in vivo. Противосвертывающее действие гепарина осуществляется при его внутривенном, внутримышечном, подкожном введении. Однако он действует относительно кратковременно.

Лейцин - алифатическая незаменимая аминокислота, которая входит в состав всех природных белков и применяется для лечения болезней печени, анемий и других заболеваний. Лейцин является специфическим источником энергии на клеточном уровне.

Комплексный препарат гепарин-лейцин имеет иную структуру, чем составляющие его компоненты. Методом пересекающегося электрофореза было доказано участие кислых - карбоксильных и сульфогрупп гепарина в комплексообразовании с лейцином. Установлено, что при использовании химически чистых препаратов высокомолекулярного гепарина и L-лейцина полная реакция их взаимодействия протекает при добавлении избытка аминокислоты (соотношение 1:3-1:4), в связи с чем все кислые (сульфатные и карбоксильные) группы гепарина были связаны с аминогруппами лейцина.

Молярное соотношение 1:3-4 является оптимальным для проявления максимальной антикоагулянтной активности комплекса гепарина с L-лейцином, что доказано методом компьютерного моделирования по универсальной компьютерной программе расчета химических равновесий AUTOEQUIL, данных pH-метрии физиологических растворов: гепарин-L-лейцин и кальций-гепарин-L-лейцин. При получении продукта проводят периодическое перемешивания образовавшейся смеси при комнатной температуре в течение 25-35 мин.

Полученный согласно предложенному способу комплекс гепарина и лейцина обладает высокой антикоагулянтной и фибриндеполимеризационной активностью, а также стабильностью при хранении. Полученный комплекс не обладает протеолитическими свойствами, что придает ему безопасность при применении. Полученный комплекс стабилен, сохраняет свои свойства при +4-6°С в течение не менее 2-х лет.

Таким образом, в отличие от прототипа целевой продукт, содержащий соединение гепарин-лейцин в молярном соотношении 1:3-4, получаемый предлагаемым способом, проявляет одновременно суммарное фибринолитическое, фибриндеполимеризационное и антикоагулянтное действие как в отсутствие плазмы, так и при добавлении к плазме крови. Комплексы, имея аналогичные составы с прототипом, значительно различаются по свойствам, полученным за счет щадящего (безопасного для структуры молекул) режима получения комплексного препарата и нового соотношения компонентов. В процессе не использовалась обработка исходного гепарина с ионообменными смолами, не использовались органические растворители для осаждения комплекса.

Предлагаемый способ позволяет получать комплексы с улучшенными свойствами, в полученном препарате антикоагулянтная активность на 150-190% превышает ту же активность исходного высокомолекулярного гепарина. Полученный препарат дополнительно обладает фибринолитической, фибриндеполимеризационной и антитромбоцитарной активностью, не проявляет побочного отрицательного протеолитического действия, продукт безопасен при возможной передозировке, так как в его состав входят природные компоненты, не проявляющие протеолитического действия. Его можно применять перорально, что также является его преимуществом. Препарат стабилен, срок хранения не менее 2-х лет. Благодаря своим свойствам целевой продукт в организме будет способен как предупреждать и снижать уровень тромбообразования, так и вызывать лизис свежих венозных тромбов при пероральном применении.

Формула изобретения

1. Способ получения антикоагулянтно-фибринолитического средства на основе высокомолекулярного гепарина, заключающийся во взаимодействии водных растворов гепарина и лейцина при перемешивании в молярном соотношении 1:3-4, образовавшийся продукт замораживают при температуре не выше -10°С и лиофильно высушивают.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что перемешивание ведут в течение 25-30 мин.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют 0,8-1,0%-ный водный раствор гепарина.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют 0,3-1,0%-ный водный раствор лейцина.

Изобретение "СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИКОАГУЛЯНТНО-ФИБРИНОЛИТИЧЕСКОГО СРЕДСТВА НА ОСНОВЕ ГЕПАРИНА" (Исаев В.А., Ляпина Л.А., Оберган Т.Ю., Николаева Л.С., Семёнов А.Н., Ершов А.А.) отмечено юбилейной наградой (25 лет Российской Академии Естествознания)
Медаль Альфреда Нобеля

Оформление наградных документов и заказ каталога