L международная выставка-презентация
научных, технических, учебно-методических и литературно-художественных изданий
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНГИБИТОРА КОЛЛАГЕНАЗ С АНТИКОАГУЛЯНТНЫМ ДЕЙСТВИЕМ ИЗ ГЕПАТОПАНКРЕАСА КАМЧАТСКОГО КРАБА
| Название | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНГИБИТОРА КОЛЛАГЕНАЗ С АНТИКОАГУЛЯНТНЫМ ДЕЙСТВИЕМ ИЗ ГЕПАТОПАНКРЕАСА КАМЧАТСКОГО КРАБА |
|---|---|
| Разработчик (Авторы) | Исаев В.А., Руденская Г.Н., Руденская Ю.А., Лютова Л.В., Балашова М.В. |
| Вид объекта патентного права | Изобретение |
| Регистрационный номер | 2403284 |
| Дата регистрации | 25.11.2009 |
| Правообладатель | Закрытое Акционерное Общество Научно-производственное предприятие "Тринита" |
Описание изобретения
Изобретение может быть использовано в биотехнологии. Проводят гомогенизацию сырья в 0,1 М ацетате аммония, содержащем 0,1-1 мМ ацетата кальция при рН 6,4-7,0. Гомогенат центрифугируют, к супернатанту добавляют сульфат аммония до 60-70%-ного насыщения. Полученный комплекс ферментов отделяют центрифугированием, растворяют в дистиллированной воде с добавлением 0,1-1 мМ ацетата кальция до получения истинного раствора. Затем очищают, концентрируют и обессоливают ферменты на поливолоконной мембране с размером пор 100 кДа. Промывают супернатант, содержащий ингибитор коллагеназы, дистиллированной водой, прогревают до 60-100°С, отделяют осадок центрифугированием. Полученный суммарный препарат ингибитора коллагеназы подвергают дополнительному растворению в 0,1 М ацетата аммония с рН 6,0-6,4, отделяют осадок центрифугированием и добавляют к супернатанту сульфат аммония 35-45% насыщения. Осадок отделяют и растворяют в 0,01 М трисовом буфере с рН 7,0-8,0. Раствор прогревают при 70-90°С, подвергают центрифугированию. Полученную сульфат-пасту растворяют в 0,05 М Трис-буфере с рН 8,0 с добавлением 0,5 М NaCl. Фракционируют гель-фильтрацией на Сефадексе G-100 с последующим концентрированием активных фракций ультрафильтрацией на мембране с размером пор 30-50 кДа. Супернатант, содержащий целевой продукт, промывают и лиофильно высушивают. Изобретение позволяет расширить ассортимент препаратов, обладающих противосвертывающим действием. 2 з.п. ф-лы, 5 ил, 4 табл.
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению высокоочищенных высокоактивных препаратов ингибиторов, которые могут быть использованы в биохимии, медицине, фармакологии, патофизиологии, для терапии тромбоэмболических заболеваний, а также для исследовательских целей.
Тромбозы и тромбоэмболии, связанные с закупоркой кровеносных сосудов тромбом, являются одним из наиболее распространенных и тяжелых осложнений сердечно-сосудистых заболеваний человека, приводящих к летальному исходу. Терапию тромбоэмболических заболеваний проводят введением тромболитических агентов, которые вызывают растворение внутрисосудистых сгустков. Например, различных протеолитических ферментов, которые непосредственно лизируют фибрин тромба (плазмин) или активаторы плазминогена, которые превращают эндогенный плазминоген в плазмин (урокиназа, стрептокиназа и др.).
Другой подход к решению проблемы заключается в использовании ингибиторов тромбина или активатора протромбина в качестве антикоагулянтов. Наиболее известные вещества такого действия - гирудин пиявки и гепарин. Известен способ получения аналога герудина, обладающего антикоагуляционной активностью, который получают путем трансформации штамма Е.coli., рекомбинантным вектором секреции, содержащим фрагмент ДНК, кодирующий целевой полипептид, а также последовательность точки начала репликации, полученной из плазмиды pUC. Проводят культивирование упомянутого штамма и аналог гирудина извлекают из клеток или культуральной среды. Способ очень трудоемкий, требует специального оборудования, что неизбежно приводит к удорожанию лекарственного средства.
[Патент RU №2106408, С12Т 15/12, опубл 10.03.1998]
Известны способы получения биологически активных препаратов с противосвертывающим действием из растительного сырья: растений, произрастающих в Южной Африке - Aspilia afrikana, или из растения, произрастающего в средней полосе европейской части России - таволги вязолистной (Filipendula ulmari), или из корней пиона Paeonia lutea. Биологически активные фракции экстрагируют из растительного сырья, инкубируют в термостатах и в последующем очищают гель-хроматографией. Из корней пиона продукт выделяют после измельчения и длительной сушки при 36.5-37.5°С, затем настаивают в темноте с 40%-ным этиловым спиртом из расчета на 1 г порошка 10 мл спирта, осадок отделяют, а надосадочную жидкость используют после разбавления ее водой до первоначального объема.
Получаемые по данному способу препараты или недостаточно активны, активности компонентов системы фибринолиза повышаются всего в 1,4-2 раза, или имеют побочные эффекты от использования фракций продукта, или из-за редкого ареала распространения вида растений сырье является труднодоступным.
[Патент RU, №2143270, А61К 35/78, 1999.12.27]
Известен способ получения биологически активного препарата с противосвертывающим из корней пиона Paeonia lutea. Целевой продукт выделяют из коры корней пиона, которые очищают, моют холодной водой, затем высушивают при 36.5-37.5°С в течение 23-25 ч, высушенную кору отделяют, измельчают до зернистопорошкообразного состояния, заливают 40%-ным этиловым спиртом из расчета на 1 г порошка 10 мл спирта, настаивают в темноте в течение 5-7 суток, осадок отделяют, а надосадочную жидкость доводят до первоначального объема дистиллированной водой. При пероральном введении препарата животным установлено повышение суммарной фибринолитической активности в 1.6 раза, активности активатора плазминогена в 2 раза, увеличение активированного частичного тромбопластинового времени в 1.4 раза. Получаемые по данному способу препараты недостаточно активны, активности компонентов системы фибринолиза повышаются всего в 1,4-2 раза, механизм действия неизвестен. [Патент RU, №2143270, А61К 35/78, 1999.12.27]
Наиболее близким по технической сущности является способ получения ингибитора коллагеназ из гепатопанкреаса камчатского краба, включающий гомогенизацию сырья, содержащего протеолитические ферменты, способ характеризуется проведением гомогенизации сырья в 0,1 М ацетате аммония, содержащем 0,1-1 мМ ацетата кальция при рН 6,4-7,0, гомогенат затем центрифугируют, к супернатанту добавляют сульфат аммония до 60-70% насыщения, полученный комплекс ферментов отделяют центрифугированием, растворяют последний в дистиллированной воде с добавлением 0,1-1 мМ ацетата кальция до получения истинного раствора с последующей очисткой, концентрированием и обессоливанием ферментов на поливолоконной мембране с размером пор 100 кДа и промывкой супернатанта, содержащего ингибитор коллагеназы дистиллированной водой 3 раза, с последующим прогреванием до 60-100°С, отделением осадка центрифугированием и лиофильным высушиванием.
Способ позволяет получить эндогенный ингибитор коллагенолитических ферментов из доступного сырья достаточно экономичным способом, однако получаемый препарат имеет невысокое антикоагулянтное действие.
[Патент РФ №2292393, C12N 9/64, опубл. 10.08.2007]
Все вышеизложенное позволяет сделать вывод, что поиск новых эффективных и безопасных антикоагулянтов остается до настоящего времени чрезвычайно актуальным.
Задачей настоящего изобретения является расширение ассортимента препаратов, обладающих противосвертывающим действием.
Поставленная задача решается способом получения ингибитора коллагеназ с антикоагулянтным действием из гепатопанкреаса камчатского краба, характеризующимся проведением гомогенизации сырья в 0,1 М ацетате аммония, содержащем 0,1-1 мМ ацетата кальция при рН 6,4-7,0, гомогенат центрифугируют, к супернатанту добавляют сульфат аммония до 60-70%-ного насыщения, полученный комплекс ферментов отделяют центрифугированием, растворяют последний в дистиллированной воде с добавлением 0,1-1 мМ ацетата кальция до получения истинного раствора с последующей очисткой, концентрированием и обессоливанием ферментов на поливолоконной мембране с размером пор 100 кДа и промывкой супернатанта, содержащего ингибитор коллагеназы, дистиллированной водой с последующим прогреванием до 60-100°С, отделением осадка центрифугированием. Полученный суммарный препарат ингибитора коллагеназы подвергают дополнительному растворению в 0,1 М ацетата аммония с рН 6,0-6,4, отделяют осадок центрифугированием и добавляют к супернатанту сульфат аммония до 35-45% насыщения, после отделения осадка последний растворяют в 0,01 М трис-буфере с рН 7,0-8,0, раствор прогревают при 70-90°С и подвергают центрифугированию, а полученную сульфат-пасту растворяют в 0,05 М трис-буфере с рН 8,0 с добавлением 0,5М NaCl и фракционируют гель-фильтрацией на Сефадексе G-100 с последующим концентрированием активных фракций ультрафильтрацией на мембране с размером пор 30-50 кДа, супернатант, содержащий целевой продукт, промывают и лиофильно высушивают.
Целесообразно прогревание раствора при температуре 70-90°С вести в течение 25-40 мин, а целевой продукт промывать не менее чем 5-ю объемами 0,02% раствора хлористого натрия.
Гепатопанкреас крабов, особенно камчатского краба, является источником протеолитических ферментов, в том числе и коллагеназ, способных образовывать комплексы с эндогенным ингибитором, коллагенолитические ферменты гепатопанкреаса краба относятся к особому семейству ферментов - брахиуринам. Это сериновые протеиназы, совмещающие в себе свойства трипсина и химотрипсина, поэтому ингибиторы металлопротеиназ на них не действуют. Гепатопанкреас является доступным, дешевым и нетоксичным сырьем для получения ферментных препаратов.
Формула изобретения
1. Способ получения ингибитора коллагеназ с антикоагулянтным действием из гепатопанкреаса камчатского краба, характеризующийся проведением гомогенизации сырья в 0,1 М ацетате аммония, содержащем 0,1-1 мМ ацетата кальция при рН 6,4-7,0, гомогенат центрифугируют, к супернатанту добавляют сульфат аммония до 60-70%-ного насыщения, полученный комплекс ферментов отделяют центрифугированием, растворяют последний в дистиллированной воде с добавлением 0,1-1 мМ ацетата кальция до получения истинного раствора с последующей очисткой, концентрированием и обессоливанием ферментов на поливолоконной мембране с размером пор 100 кДа и промывкой супернатанта, содержащего ингибитор коллагеназы, дистиллированной водой с последующим прогреванием до 60-100°С, отделением осадка центрифугированием, полученный суммарный препарат ингибитора коллагеназы подвергают дополнительному растворению в 0,1 М ацетата аммония с рН 6,0-6,4, отделяют осадок центрифугированием и добавляют к супернатанту сульфат аммония до 35-45%-ного насыщения, после отделения осадка последний растворяют в 0,01 М трис-буфере с рН 7,0-8,0, раствор прогревают при 70-90°С, подвергают центрифугированию, а полученную сульфат-пасту растворяют в 0,05 М трис-буфере с рН 8,0 с добавлением 0,5М NaCl и фракционируют гель-фильтрацией на Сефадексе G-100 с последующим концентрированием активных фракций ультрафильтрацией на мембране с размером пор 30-50 кДа, супернатант, содержащий целевой продукт, промывают и лиофильно высушивают.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что прогревание раствора при температуре 70-90°С ведут в течение 25-40 мин.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что целевой продукт промывают не менее чем 5 объемами 0,02%-ного раствора хлористого натрия.
Медаль Альфреда Нобеля