Способ определения окислительного потенциала клеток с применением бихроматометрии

Название	Способ определения окислительного потенциала клеток с применением бихроматометрии
Разработчик (Авторы)	Зиновьев Сергей Викторович, Плехова Наталья Геннадьевна, Радьков Иван Валерьевич
Вид объекта патентного права	Изобретение
Регистрационный номер	2798290
Дата регистрации	21.06.2023
Правообладатель	Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего "Тихоокеанский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (RU)
Область применения (класс МПК)	МПК G01N 3/00 (2006.01) G01N 33/50 (2006.01)

Описание изобретения

Изобретение относится к медицине и биологии, касается оценки токсического влияния бактериальных липополисахаридов (ЛПС) на организм. Доказано, что изменение окислительно-восстановительных процессов в клетках лежат в основе гомеостаза организма при адаптации к патологическому состоянию при инфицировании различными бактериями [1]. В связи с этим, существует необходимость цитохимической оценки состояния клеток крови в организме при различных заболеваниях [2]. Бихроматная окисляемость отражает потребление кислорода клетками при химическом окислении сернокислым раствором бихромата калия- K2Cr2O7 (БХ) внутриклеточных субстратов-восстановителей [3]. Бихроматометрия протекает в сильно-кислой среде и при кипячении водного раствора редокс потенциал БХ равен Е=+1,33 [4]. При слабокислом, нейтральном, слабощелочном рН редокс-потенциал (стандартный электродный потенциал) раствора БХ равен Е=-0,12 [4]. БХ и хромат-ион H2CrO4 в нейтральной среде имеет степень окисления 6+, при взаимодействии с восстановителем его потенциал снижается до 3+с образованием гидроксокомплекса хрома [5]. При обработке растворами БХ биологических объектов, где рН=7,2, происходит восстановление степени окисления хромат-ион H2CrO4 - 6+ в 3+, с образованием гидроксокомплексов. При дублении (олификации) такие гидроксокомплексы агрегируют вещества в многоядерные (полиядерные) частицы посредством донорско-акцепторных связей функциональных групп различных полипептидов и других органических веществ [6, 9]. Так, в гидроксокомплексы хрома 3+включены длинные цепочки, чередующихся друг с другом гидроксогрупп и хрома, которые взаимодействуют с аминогруппами, сульфонатами, ароматическими аминами и др. [6 9, 712]. Сульфонаты образуют с аминами ароматические амины и сульфамиды, что приводит к сульфонатной дериватизации аминокислот и азотистых оснований [8 11]. 1,2-нафтохинон-4-сульфонат (1,2НХ4С) является изомером предшественника витамина К-1,4 нафтохинона и субстратом для выявления активности оксиредуктаз, образуя аддукты с белками и ДНК [9-12 14-17]. В водном растворе при рН=7,0 БХ не может окислить субстрат 1,2НХ4С по причине высокого содержания его восстановленных форм. Известно, что редокс-потенциал (Е) 1,2НХ4С при рН=1,0 равен Е=+0.628 В [13 6]. С применением упрощенного уравнения Эрнста редокс-потенциал пары окисленного и восстановленного 1,2НХ4С можно рассчитать Е=Е0-0,059×рН [14 7]. Таким образом, при рН=7,0 раствора редокс-потенциал 1,2НХ4С равен Е=+0,218 В. Тогда как, в клетках определен низкий редокс-потенциал <Е=-0,12 для следующих белковых компонентов: НАДН/НАД, НАФН/НАДФ, цистеин/цистин, цистеиновая кислота, глутатион восстановленный/окисленный, липоевая кислота и др. [15 8]. Поэтому для выявления окислительного потенциала клеток необходимы подходы для выявления активности таких восстановителей в водных растворах.

Известны индикаторные методы бихроматометрии основанные на применении различных редокс-индикаторов (дифениламин, дифениламиносульфокислота, фенилантраниловая кислота), в том числе хемилюминесцентных, а также внешних [3].

К недостаткам таких способов бихроматометрии относится химическая агрессивность используемых реагентов, что существенно затрудняет исследование окислительного потенциала клеток в цитологических и гистологических препаратах. Это обосновано тем, что для окисления субстрата редокс-потенциал окислителя должен быть выше, чем у восстановителя [5].

Наиболее близким к заявляемому способу относится метод цитологического флуоресцентного (ФЛ) исследования эритроцитов (Эр), который осуществляется путем окрашивания спиртовым раствором ализарина красного С (АКС) и водным раствором бихромата (БХ) мазков периферической крови [16 13]. В цитоплазме Эр выявляются флуоресцирующие гранулы, которые подсчитываются в препаратах периферической крови у интактных животных, при охлаждении, черепно-мозговой травме, ортостатическом вывешивании без воздействия эндотоксинов.

К недостатку этого способа относится структурная особенность молекулы АКС, где присутствуют карбонильные и гидроксильные (фенольные) группы, что затрудняет анализ причин окисления БХ внутриклеточными субстратами, который может взаимодействовать с фенолами АКС. Также, к недостатку этого способа [16 13], относится отсутствие водного раствора 1,2НХ4С, так как применяется раствор АКС в 96° этаноле. При этом известно, то, что в растворе этанола образуется хингидрон-межмолекулярный комплекс восстановленного и окисленного хинона [17 18]. Также в этом способе, окислительно-восстановительная реакция ароматических аминов выявляется с помощью оценки гранул ФХ только в цитоплазме Эр периферической крови [13]. Недостатком известного способа является, что с его помощью не изучаются кортикоциты коркового слоя надпочечников (Нп), головного мозга (Гм), легких (Лг).

Техническим результатом заявляемого способа является цитохимическая оценка реакции окисления БХ внутриклеточных субстратов с низким редокс-потенциалом (менее Е=-0,12 Мв) в водном растворе при рН=7.0, в результате которой степень окисления хромата иона 6+восстанавливается до 3+ с образованием гидроксокомплекса хрома, включающего гранулы флуорохрома (Фх). С помощью заявленного способа возможно прогнозирование степени олификации гидроксокомплексов хрома 3+ в клетках различных органов, что позволяет оценить в них уровень обмена веществ по включению производных сульфоновых кислот (цистеиновая кислота, таурин), сульфамидов, производных никотиновой кислоты (пиколинаты и др.) и других ароматических аминов, аминокислот в физиологических пределах значений рН.

Отличием заявленного способа является выявление при микроскопии гистологических препаратов, окрашенных БХ, флуоресцирующих агрегатов гидроксокомплексов хрома 3+, как в Эр периферической крови, так и в ядрах клеток паренхимы различных органов.

Уровень техники заявляемого способа заключается в выявлении в клетках веществ с редокс потенциалом менее Е=-0,12 В путем восстановления степени окисления гидроксокомплексов хрома от 6+ к 3+, которое сопровождается формированием флуоресцирующих гранул, содержащих ароматические амины и др., с возможностью их количественного учета с применением микроскопии. Наличие таких гранул позволяет учитывать содержание гидроксокомплексов переходных металлов в клетках при формировании взаимодействия ароматических веществ и их таутомерию.

Задача способа оценить с помощью гистохимического исследования число флуоресцирующих гранул красителя в цитоплазме Эр и ядре клеток различных органов, что позволяет оценить состояние организма при различных заболеваниях. Существо заявленного способа, заключается в оценке бихроматной окисляемости внутриклеточных восстановителей с применением флуоресцентной микроскопии микропрепаратов крови и тканей органов интактных и животных с эндотоксинемией (троекратное введение бактериального липополисахарида в дозе 33,33 мкг/кг), а именно, подсчитывается количество флуоресцирующих гранул гидроксокомплексов, которые образуются в цитоплазме и ядре клеток при гистохимическом окрашивании.

Признаки, используемые для осуществления необходимых условий выполнения заявляемого способа: мазки периферической крови и кусочки тканей органов интактных и животных с эндотоксинемией фиксируются в 96° этиловом спирте в течении 24 часов, затем образцы тканей промываются в хлороформе и заливаются в парафин, после чего изготавливаются гистологические препараты тканей, мазки крови и микропрепараты окрашивается в течение 5 мин в 5% растворе 1,2-нафтохинон-4-сульфоната (1,2НХ4С) на основе 96 этилового спирта, перемещаются в 5% раствор 1,2 НХ4С на основе бидистиллированной воды на 5 мин, промываются бидистиллированной водой в течении 20 сек, перемещаются в 5% насыщенный раствор бихромата в бидистиллированной воде на 2 мин, вновь промываются в бидистиллированной воде 20 сек, сушатся на воздухе, после чего покрываются нефлуоресцирующим иммерсионным маслом, готовые микропрепараты просматриваются с помощью флуоресцентного микроскопа при увеличении ×1000, волна возбуждения 615 нм, подсчитывается флуоресцирующих эритроцитов и ядер клеток в 30 полях зрения, в качестве контрольных препаратов используются мазки крови и гистологические срезы, фиксированные в парах формальдегида, что исключает свечение клеток.

Пример использования изобретения. Способ применили для исследования состояния клеток крови и органов животных (белые крысы Wistar, самцы весом 250 грамм) без введения препаратов - 1 группа, при внутримышечном введении эндотоксина (липополисахарид, ЛПС, пирогенал) в дозе 33,33 мкг/кг на 1, 3, 4 сутки эксперимента -2 группа и 3 группа животных изучается на 6 день после троекратного внутримышечного введения пирогенала в дозе 33,33 мкг/кг на 1, 3, 4 сутки эксперимента. Для воспроизведения эндотоксинемии животным вводили фармакопейную форму ЛПС раствор пирогенала (р-р для в/м введ. амп., 100 мкг, 1 мл, "МЕДГАМАЛ" ФГБУ "НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи" Минздрава России). Общую анестезию проводили с помощью внутримышечного введения золетила 100 в дозе 20 мг/кг («Virbac» Франция), после чего осуществлялась вивисекция с целью забора периферической крови из сердца и органов. Из периферической крови изготавливались мазки на предметных стеклах. Для гистохимического исследования тканей надпочечников, легких, головного мозга кусочки органов фиксировались в 96° этиловом спирте в течение 24 ч, после чего материал промывали в хлороформе и заливали в парафин. На микротоме изготавливали срезы толщиной 5 мкм, помещали на предметные стекла с адгезивным покрытием, депарафинировали. Окраску проводили согласно заявляемому способу с использованием 1,2Н4С (ЛенРеактив, Россия) и бихромата калия (ЛенРеактив, Россия). Обработанные мазки крови и гистологические срезы просматривали под флуоресцентным микроскопом Zeiss Scope A1 (Zeiss, Германия) при возбуждающей длине волны 470 нм, 510-590 нм, 615 нм. Оценка выхода эмиссии флуоресценции осуществлялась при длине волны красного (630-760 нм) спектра.

Контроль специфичности флуоресценции (Фл) клеток, осуществляется при гистохимической окраске мазков крови и микропрепаратов тканей органов животных раствором БХ без включения 1,2 НХ4С и параллельно раствором, содержащим 1,2 НХ4С без БХ. Свечение клеток в таких препаратах отсутствовало при всех используемых диапазонах возбуждающей длины волны (360, 470, 510-590, 615 нм). Также не обнаружено свечения клеток при фиксации в парах формалина мазков крови, окрашенных 1,2НХ4С. При окрашивании мазков крови и препаратов с помощью заявленного способа кортикоцитов надпочечников интактных животных (1 группа) обнаружена Фл ядер клеток в большом количестве при длине волны возбуждения 615 нм и эмиссии 630-760 нм, при других диапазонах длин волн свечения клеток не выявлено. В мозговом веществе надпочечников флуоресцировали единичные клетки. На 4 (2 группа), 6 день (3 группа) после введения ЛПС обнаружено достоверное снижение количества флуоресцирующих кортикоцитов надпочечников (табл. 1).

При исследовании препаратов крови, окрашенных 1,2 НХ4С с БХ, в цитоплазме эритроцитов выявлены флуоресцирующие гранулы. Эритроциты по степени флуоресценции разделены на 5 типов: 1 тип - без флуоресценции, 2 тип - разрозненная (1-5 гранул) гранулярная Фл цитоплазмы, 3 тип - флуоресцирующая разрозненная гранулярная окраска части периферии (тора) цитоплазмы, центральная часть клетки не окрашена, 4 тип - периферия цитоплазмы (тор) содержит флуоресцирующие крупные гранулы не менее 0,5 мкм в диаметре, 5 тип - полностью флуоресцирующие клетки. Количественная оценка цитохимической реакции проводится при подсчете среднего цитохимического коэффициента по пятибалльной системе, изложенном в известном способе [13]. Определено снижение СЦК Эр у периферической крови животным при введении ЛПС, что отражает изменение содержания восстановителей, выявляемых с помощью цитохимической хроматометрии (табл. 1).

При исследовании с помощью заявленного способа ядер клеток нервной ткани промежуточного мозга таламуса и гипоталамуса, а так же легких выявляется небольшая Фл клеток. У интактных животных они единичны (1-4) в гистологических срезах ГМ и легких. Фл нейронов отсутствует, в мозговых оболочках, кровеносных сосудах базальной поверхности промежуточного мозга и его поверхностных слоях, предлежащих к гипоталамусу отмечается свечение ядер клеток, диаметром 4-6 мкм. На 4 день после введения пирогенала (2 группа) отмечается существенное повышение количества флуоресцирующих ядер клеток в тканях легких и головного мозга (мозговые оболочки, кровеносные сосуды, поверхностные слои базальной части промежуточного мозга, предлежащей к гипоталамусу), которое значимо снижется на 6 день эксперимента- 3 группа (табл. 1). В легких выявляется слабая Фл стенки кровеносных сосудов артерий и вен. Технически результат заявленного способа заключается в том, что с помощью цитохимической бихроматометрии демонстрируется участие редокс-потенциала восстановителей, которые локализуются в ядрах кортикоцитов надпочечников, промежуточного мозга, легких, и принимают участие в регуляции окислительного стресса с помощью легкоокисляемых субстратов при введении ЛПС в организм и рН реагентов водного раствора бихромата и 1,2НХ4С равным 7,0.

Источники информации:

1. Мартинович Г.Г., Черенкевич С.Н. Окислительно-восстановительные процессы в клетках: Монография. - Мн.: БГУ, 2008. - с. 159.

2. Alekseeva I.V., Abramova A.Yu., Kozlov A.Yu., Koplik E.V., Pertsov A.S., Lyadov D.A., Nikenina E.V., Pertsov S.S. Bull. Exp.Biol. Med. 2019; Vol. 167, №5. - p. 624-627.

3. Алексеев B.H. Количественный анализ.- M.: Химия, 1972.

4. Бабко А.К., Пятницкий И.В. Количественный анализ. 2 изд., пер. и доп. - М.: "Высшая школа", 1962. - 508 с.

5. Шульц М.М., Писаревский А.М., Полозова И.П. Окислительный потенциал. Теория и практика. - Л.: Химия. 1984].

6 9. Sudesh Vasdev, Vicki Gill Antioxidants in the treatment of hypertension Angiol 2005; 14(2). - p. 60-73.

7. Elbashir A.A., Ahmed A.A., Ahmed Sh. M.A., Aboul-Enein H.Y. l,2-Naphthoquinone-4-Sulphonic Acid Sodium Salt (NQS) as an Analytical Reagent for the Determination of Pharmaceutical Amine by Spectrophotometry, Applied Spectroscopy Reviews. 2012; 47:3. - p. 219-232.

8. Павлов H.H. Неорганическая химия. Учеб. для технол. спец. вузов. - М.: Высш. шк., 1986. - 336 с.

9. Способ флуоресцентной цитохимической оценки содержания биогенных аминов в эритроцитах Зиновьев С.В., Плехова Н.Г., Радьков И.В., Лаптев В.В. Патент RU 2709212 С1. 2018, Бюл. №35.

10. Yoshito Kumagai, Yasuhiro Shinkai, Takashi Miura, Arthur K. Cho The Chemical Biology of Naphthoquinones and Its Environmental Implications Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 2012; 52(1). - p. 221-247.

11. Kim S.Y., Mori Т., Chek M.F., Furuya S., Matsumoto K., Yajima Т., Ogura Т., Hakoshima T. Structural insights into vesicle amine transport-1 (VAT-1) as a member of the NADPH-dependent quinone oxidoreductase family. Sci Rep. 2021;11(1). - p. 2120.

12. Soares AG, Muscara MN, Costa SKP. Molecular mechanism and health effects of 1,2-Naphtoquinone. EXCLI J. 2020; 1. - p. 707-717.

13. Окислительно-восстановительное титрование: [учеб.-метод. пособие] / [сост. А.Л. Подкорытов, Л.К. Неудачина, С.А. Штин; М-во образования и науки. Рос. Федерации, Урал. федер. ун-т]. - Екатеринбург: Изд-во Урал, ун-та, 2015 - 64 с

14. By W. Mansfield Clark. Oxidation-reduction potentials of organic systems. The Williams & Wilkins Co., 428 East Preston St., Baltimore 2, Md., 1960. - 584 pp.

15. Неницеску К.Д. Органическая химия. 1963; II том,. Изд-во: М.: иностранной литературы, 1963 г. - 1048 с.

16. Shevchenko N., Zaitsev V., Walcarius A. Bifunctionalized mesoporous silicas for Cr(VI) reduction and concomitant Cr(III) immobilization Cr(III) binding to sulfonate groups Environ Sci Technol. 2008; 42(18). - 6922-8.

17. Физическая химия. Под ред. акад. Никольского Б.П. Л.: Химия, 1987. - 880 с.

Формула изобретения

Способ определения окислительного потенциала клеток с применением бихроматометрии, включающий определение окислительного потенциала клеток крови и тканей различных органов на гистологических препаратах, отличающийся тем, что микропрепараты окрашиваются в течение 5 мин в 5% растворе 1,2-нафтохинон-4-сульфоната (1,2 НХ4С) на основе 96° этилового спирта, перемещаются в его 5% раствор на основе бидистиллированной воды на 5 мин, промываются ею в течение 20 с, перемещаются в 5% насыщенный раствор бихромата калия в бидистиллированной воде на 2 мин, вновь промываются в бидистиллированной воде 20 с, сушатся на воздухе, после чего покрываются нефлуоресцирующим иммерсионным маслом и просматриваются под флуоресцентным микроскопом при увеличении ×1000 и волне возбуждения 615 нм, для подсчета флуоресцирующих клеток в 30 полях зрения в качестве контрольных препаратов используются мазки крови и гистологические срезы, фиксированные в парах формальдегида, что исключает свечение клеток.

Изобретение "Способ определения окислительного потенциала клеток с применением бихроматометрии" (Зиновьев Сергей Викторович, Плехова Наталья Геннадьевна, Радьков Иван Валерьевич) отмечено юбилейной наградой (25 лет Российской Академии Естествознания)
Медаль Альфреда Нобеля

Оформление наградных документов и заказ каталога