ШТАММ ENTEROCOCCUS FAECIUM LVP1073, ПРОДУЦЕНТ БАКТЕРИОЦИНА ПРОТИВ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПАТОГЕНОВ, БАКТЕРИОЦИН E1073 ПРОТИВ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПАТОГЕНОВ, ШТАММ LACTOBACILLUS PLANTARUM 1 LVP7 - ИНДУКТОР СИНТЕЗА БАКТЕРИОЦИНА E1073, СИГНАЛЬНЫЙ ПЕПТИД СП1073 - РЕГУЛЯТОР СИНТЕЗА БАКТЕРИОЦИНА E1073, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИОЦИНА E1073

Название	ШТАММ ENTEROCOCCUS FAECIUM LVP1073, ПРОДУЦЕНТ БАКТЕРИОЦИНА ПРОТИВ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПАТОГЕНОВ, БАКТЕРИОЦИН E1073 ПРОТИВ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПАТОГЕНОВ, ШТАММ LACTOBACILLUS PLANTARUM 1 LVP7 - ИНДУКТОР СИНТЕЗА БАКТЕРИОЦИНА E1073, СИГНАЛЬНЫЙ ПЕПТИД СП1073 - РЕГУЛЯТОР СИНТЕЗА БАКТЕРИОЦИНА E1073, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИОЦИНА E1073
Разработчик (Авторы)	Светоч Э.А., Перелыгин В.В., Ерусланов Б.В., Левчук В.П., Похиленко В.Д., Мицевич Е.В., Мицевич И.П., Лунева Н.И., Борзенков В.Н., Светоч О.Е., Дятлов И.А.
Вид объекта патентного права	Изобретение
Регистрационный номер	2409661
Дата регистрации	12.02.2009
Правообладатель	Федеральное государственное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии

Описание изобретения

Изобретение относится к области биотехнологии, ветеринарии, в частности к снижению содержания бактериальных патогенов в условиях, связанных с производством экологически чистых продуктов питания.

Уровень техники

Известно, что основной причиной заболевания людей пищевыми инфекциями является употребление продуктов питания, контаминированных бактериальными патогенами (клостридиями, кампилобактериями, сальмонеллами и др.), которые обитают в желудочно-кишечном тракте животных, в том числе у бройлерной птицы. Пищевые инфекции, по оценке ВОЗ, уносят ежегодно три миллиона жизней людей и наносят серьезный экономический ущерб даже в развитых странах, например в США ущерб от пищевых инфекций составляет от 6,5 до 34,9 миллиардов долларов (Buzby, J.C. et al., 1997, USDA, Economic Research Service, AER-756). Борьба с носительством бактериальных патогенов у сельскохозяйственных животных является актуальной задачей ветеринарии и медицины.

Для сдерживания роста и колонизации клостридиями, сальмонеллами и кампилобактериями кишечника птицы, а также последующего снижения содержания патогенов в мясе птицы при производстве бройлеров используют микрофлору кишечника здоровой птицы, либо чистые культуры микробных антагонистов - пробиотические штаммы (Nurmi and Rantala, 1973, Nature 241: 210-211; Stern, 1994, Poultry Science 73: 402-407; Патент США 5451400). Наиболее часто используются виды: Lactobacillus species, Bifidobacterium species, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Lactococcus lactis, Streptococcus cricetus, Leuconostoc mesenteroides, Pediococcus acidilactici, Sporolactobacillus inulinus, Streptococcus thermophilus. Следует, однако, отметить, что применение живых культур (пробиотиков) для лечения животных часто осложнено необходимостью длительного поддержания культур в жизнеспособном состоянии, использования протекторов для обеспечения хранения культур в замороженном или высушенном состоянии, а также трудностями дозирования культур для получения лечебного эффекта.

Известно, что большинство видов лактобактерий являются продуцентами различных антимикробных соединений, низкомолекулярных пептидов - бактериоцинов (Tagg et al., 1976, Bacteriol. Rev. 40: 722-756; Barefoot and Klaenhammer, 1984, Agents Chemother. 26: 328-334), бактериоциноподобных субстанций или иных химических соединений небелковой природы (Hamdan and Mikolajcik, 1974; Journal of Antibiotics 8: 631-636; Mikolajcik and Hamdan, 1975, Cult. Dairy Prod J 12: 8; Shahani et al., 1976, Cult Dairy Prod J 11: 14-17). С точки зрения практического применения наибольший интерес вызывают бактериоцины.

Бактериоцины - это рибосомально синтезируемые бактериями низкомолекулярные пептиды, обладающие антимикробными свойствами. В соответствии с классификацией Klaenhammer они подразделяются на три класса, из которых наиболее изучены и практически значимы бактериоцины класса 1, типичный представитель - низин, и бактериоцины класса 2 - так называемые педиоциноподобные бактериоцины, типичный представитель - педиоцин. Класс 3 - это большие неустойчивые к высокой температуре белки, например гельветицин J. Пока только один бактериоцин - низин, относящийся к классу 1, нашел широкое применение в индустрии кормов и продовольствия, в отношении других бактериоцинов до сих пор проводятся исследования с целью оценки возможности их практического использования.

В последнее десятилетие внимание исследователей привлечено к лактобактериям из рода Enterococcus как потенциальным продуцентам бактериоцинов, в частности к виду Enterococcus faecium, который имеет широкое практическое применение в производстве ферментированных продуктов питания, кормов и в приготовлении пробиотических препаратов (Franz and Holzapfel, 2004, Hoang-Dung Tran and friends. 6). Некоторые представители рода Enterococcus являются продуцентами бактериоцинов (энтероцинов), которые интенсивно изучаются в последние годы как потенциальные биопрезерванты (Ennahar et al., 2000, FEMS Microbiol. Reviews, 24, 85-106; Eijsink et al., 2002, Antonie van Leeuwenhoek, 81, 639-654).

Энтероцины, произведенные штаммами рода Enterococcus, ингибируют рост преимущественно грамположительных бактерий, включая представителей родов Listeria и Lactobacillus. Только некоторые из исследованных энтероцинов были способны ингибировать рост грамотрицательных бактерий. Так, например, энтероцины, синтезированные штаммами Enterococcus mundtii 39 и 115 (Ferreira et al., 2007, Brazilian Archives of Biology and Technology, Vol.50, n.2: pp.249-258), энтероцин 012, продуцируемый штаммом Enterococcus gallinarum (Jennes et al., 2000, J. of Appl. Microbiol., 88, 349-357), подавляли рост Salmonella Enteriditis. Энтероцин A, продуцируемый штаммом Enterococcus faecium EK13, ингибировал рост Salmonella enterica Dusseldorf, но не влиял на рост E.coli (Laukova et al., 2004, Vet. Med. - Czech, 49, (2): 47-51). Ограниченный спектр антимикробного действия известных энтероцинов, таким образом, является основным недостатком, лимитирующим возможности их практического применения.

Известны попытки повышения антибактериальной эффективности бактериоцинов лактобактерий в отношении грамотрицательных патогенов путем сочетанного воздействия энтероцитов и химических реагентов или электрического поля (Molinos et al., 2008, Food and Chemical Toxicology 46, 2912-2921). Такой подход, однако, усложняет и удорожает методику использования бактериоцинов, и он далеко не всегда бесспорен. Следовательно, поиск бактериоцинов, которые могли бы обладать сопоставимой антимикробной активностью как в отношении грамположительных, так и грамотрицательных бактериальных патогенов является актуальной задачей.

Несмотря на то что энтероциты способны ингибировать рост большинства известных видов грамположительных микроорганизмов, их активность в отношении спорообразующих патогенов обычно не высока. Например, бактериоцины - энтероцин A и энтероцин B, продуцируемые штаммом Enterococcus faecium Т136, не подавляли рост Clostridium perfringens и Clostridium botulinum при использовании даже относительно высоких концентраций, соответственно 3,75 мкг/мл и 5 мкг/мл (Casaus et al., Microbiology 1997, 143, 2287-2294). Как известно, Clostridium perfringens является возбудителем некротического энтерита у цыплят и этот патоген является причиной массового падежа птицы в условиях ее индустриального производства. Он также служит причиной пищевой инфекции и газовой гангрены у человека. Борьба с C.perfringens является важным направлением в области ветеринарии и медицины и поэтому поиск бактериоцинов, которые могут быть использованы вместо антибиотиков и химиопрепаратов, является важной задачей.

Известны новые штаммы рода Enterococcus, которые выделены из птиц и которые производят новые бактериоцины, способные ограничивать рост и развитие бактериальных патогенов грамотрицательной и грамположительной природы. Так, штамм Enterococcus faecalis NRRL B-30645 продуцирует бактериоцин энтероцин LWP21, который состоит из фракции 1 (мол. масса 2786 Да, pI 5.6) и фракции 2 (мол. масса 4986 Да, pI 8.4 (пат. США №7132102).

Известен также штамм Enterococcus durans (NRRL В-30511), который продуцирует бактериоцин LWP26 с мол. массой 3231 Да, pI 7.8 (патент США №7132102). При оценке антимикробной активности с использованием тестовых штаммов C.jejuni ATTC 11168, S.Enteritidis и E.coli 0157:Н7 значимо активными оказались только фракция 2 бактериоцина LWP 21 и бактериоцин LWP 26. Фракция 1 бактериоцина LWP 21 антагонистической активности против указанных тестовых штаммов не проявила (патент США №7132102). Следует отметить низкий уровень активности этих бактериоцинов в отношении C.perfringens, а также наличие признака гемолитичности у указанных штаммов-продуцентов, что ограничивает возможности их практического использования.

Указанные бактериоцины были получены путем глубинного культивирования штаммов-продуцентов, без применения дополнительных приемов, например индукторов или активаторов синтеза бактериоцина (патент США №7132102).

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является штамм Enterococcus faecium NRRLB-30746, продуцирующий бактериоцин - энтероцин E50-52, имеющий молекулярную массу - 3932 Да и pI 7.8 (US Patent 20060223161).

В отличие от известных энтероцинов бактериоцин E50-52 проявляет in vitro высокий уровень антимикробной активности по отношению к патогенам, в том числе к их грамотрицательным представителям - Campylobacter и Salmonella spp. Минимальные подавляющие концентрации (МПК) этого бактериоцина для некоторых грамположительных и грамотрицательных патогенов варьируют от 0.1 мкг/мл до 0.05 мкг/мл, но активность этого бактериоцина в отношении патогенных C.perfringens невысока (выше 5,0 мкг/мл). Следует отметить отсутствие данных об уровне антимикробной активности этого бактериоцина in vivo, например, в отношении инфекций, вызванных у птиц C.perfringens, а также Campylobacter и Salmonella spp.

Таким образом, указанные бактериоцины недостаточно эффективны как по широте спектра действия, так и по уровню ингибирования бактериальных патогенов, особенно C.perfringens, и поэтому поиск новых еще более эффективных бактериоцинов является актуальным.

Известен штамм индуктор Lactococcus lactis NNRL В-30744, увеличивающий продукцию бактериоцина E50-52 штаммом-продуцентом Enterococcus faecium NRRLB-30746. Однако установлено, что этот штамм-индуктор может быть использован только для получения бактериоцина E50-52, и он не активен в сочетании с другими штаммами-продуцентами (патент США №7534904).

Известно также, что выход бактериоцина при совместном культивировании штамма продуцента и штамма индуктора дополнительно увеличивается, если в среду культивирования в определенное время добавляется сигнальный пептид (патент США №7534904). Так, для получения больших количеств бактериоцина E50-52, продуцируемого штаммом Enterococcus faecium NRRLB-30746, в присутствии штамма индуктора Lactococcus lactis NNRL В-30744 в среду культивирования на 2-м часу выращивания добавляли фракцию пептида LWP50-52, имеющего мол. вес. 3,1 кДа и pI 8,1. Эта фракция, обозначенная как сигнальный пептид, была эффективна только в отношении штамма-продуцента - Enterococcus faecium NRRLB-30746 и не могла быть использована для активации синтеза бактериоцинов у других штаммов-продуцентов (патент США №7534904).

Известен способ получения бактериоцина E50-52, который заключается в совместном выращивании в среде бруцелло-бульона штамма-продуцента Enterococcus faecium NRRLB-30746 и штамма-индуктора Lactococcus lactis NNRL В-30744, при добавлении на 2 часу выращивания культур сигнального пептида LWP50-52, имеющего мол. вес. 3,1 кДа и pI 8,1, с последующим сбором КЖ через 12 часов и центрифугированием для получения супернатанта и осадка клеток. С целью более полного сбора бактериоцина клеточный осадок на этапе центрифугирования смешивают с элюирующим раствором, который изготавливается из фосфатного буфера, содержащего 0,7% хлористого натрия. Суспензия перемешивается и инкубируется с последующим центрифугированием для удаления клеток, а бактериоцин из полученного супернатанта выделяется сначала с помощью хроматографии гидрофобного взаимодействия, а затем ионообменной хроматографии на Superose SP FF (патент США №7534904).

Однако этот способ может быть реализован только для получения бактериоцина E50-52, так как требует высокоспецифичных штамма-продуцента, штамма-индуктора, сигнального пептида и определенной последовательности и времени осуществления процедур на этапах получения, выделения и очистки.

Задачей настоящего изобретения является получение нового штамма-продуцента бактериоцина и бактериоцина, обладающего широким спектром действия, более высокой бактерицидной активностью, потенциально пригодного для устранения бактериальных патогенов в технологии производства продуктов питания вместо антибиотиков и хлорсодержащих препаратов.

Сущность изобретения

Поставленная задача решается тем, что предложен штамм Enterococcus faecium LVP1073 - продуцент бактериоцина Е1073 против бактериальных патогенов.

Предложен бактериоцин E1073 против бактериальных патогенов, состоящий из 34 аминокислот с мол. весом 3256 Да, изоэлектрическая точка pI 8.2, имеющий структурную формулу TSYVYGNGVKENIAGEVRKGWGSGVAWDVDWKLA,

где имеется общий для бактериоцинов класса 2 мотив YGNGV и наличие фрагмента WG, отстоящего от начала консенсуса на 15 аминокислот.

Предложен штамм Lactobacillus plantarum 1 LVP7, который является индуктором синтеза бактериоцина E1073.

Предложен сигнальный пептид СП1073 - регулятор синтеза бактериоцина E1073. Сигнальный пептид специфичен, выделен из среды культивирования штамма продуцента бактериоцина E.faecium LVP 1073, молекулярная масса этого пептида, определенная с помощью гель-фильтрации на смоле Superosa 12H/R, составляет 2,1 кДа, изоэлектрическая точка pI пептида равна 8.1.

Предложен способ получения бактериоцина E1073, включающий совместное культивирование на среде МРС бульон (de Man, Rogosa, Sharpe - MRS-broth, HiMedia, Laboratories Limited, India) штамма-продуцента E.faecium LVP 1073 и штамма индуктора - Lactobacillus plantarum 1 LVP7 при добавлении на 10 часу стадии выращивания культур сигнального пептида СП1073. Очистку активной пептидной фракции из бесклеточного супернатанта КЖ проводят в два этапа. На первом - очистку пептида проводят с помощью ионообменной хроматографии, используя смолу SP-Sepharose FF, на втором - с помощью хроматографии гидрофобного взаимодействия на смоле Octyl-Sepharose 4FF (Amersham Pharmacta Biotech, Швеция). Оба этапа хроматографии выполняли на приборе ACTA FPLC (Amersham Pharmacta Biotech, Швеция). Количество полученного бактериоцина в элюате оценивают спектрофотометрически по поглощению на 215 нм.

Штамм-продуцент бактериоцина Enterococcus faecium LVP 1073 и штамм-индуктор синтеза бактериоцина E1073 Lactobacillus plantarum 1 LVP7 депонированы в коллекции микроорганизмов Государственного научного центра прикладной микробиологии и биотехнологии (ГНЦ ПМБ) и имеют коллекционные номера В-5736 и В-5943, соответственно.

Штамм Enterococcus faecium (E. faecium) LVP 1073 выделяют из содержимого слепого отростка здорового взрослого бройлера.

Штамм Enterococcus faecium LVP 1073 - продуцент бактериоцина E1073 характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки.

Штамм представляет собой грамположительные неподвижные (в полужидком МРС агаре культура растет в пробирке строго по ходу укола) кокки диаметром 0,5 мкм, расположенные в мазках одиночно, по два или в виде групп. На чашках с МРС агаром через 24 ч роста при 37°C штамм образует округлой формы с ровными краями серовато-белые, блестящие, выпуклые с гладкой поверхностью колонии диаметром ~0,5 мм, через 48 ч роста диаметр колонии достигает 1 мм. Штамм хорошо растет на бруцелло-бульоне и бруцелло-агаре (HiMedia, India), на средах с гидролизатом рыбной муки (ГНЦ ПМБ, Россия). Оптимальный показатель pH среды для роста штамма - 6,5.

Биохимические признаки.

Штамм растет в аэробных, микроаэрофильных и анаэробных условиях при температуре 10 и 45 градусов, не растет при 50 градусах, на средах с 0,04% теллурита, с 0,1% раствором метиленового синего, не образует желтого пигмента и каталазы, гидролизует аргинин и гиппурат, не обладает гемолитической активностью, не образуют кислоты при расщеплении ксилозы, рамнозы, раффинозы и глицерина, образует кислоту из сахарозы, лактозы.

Антагонистическая активность.

Штамм проявляет in vitro выраженную антагонистическую активность против многих грамположительных и грамотрицательных патогенов, включая трех индикаторных штаммов: грамположительных спороформирующих клостридий (C.perfringens), грамотрицательных кампилобактерий (C.jejuni) и сальмонелл (S.Enteritidis 237).

Тинкториальные признаки.

Клетки штамма окрашиваются по Грамму положительно, хорошо окрашиваются метиленовой синью и основным фуксином.

Промышленная применимость.

Задача настоящего изобретения решена тем, что предложен новый штамм Enterococcus faecium LVP 1073 - продуцент нового бактериоцина E1073, активного против бактериальных патогенов; предложен штамм Lactobacillus plantarum 1 LVP7 - индуктор синтеза бактериоцина E1073; штаммы Enterococcus faecium LVP 1073 и Lactobacillus plantarum 1 LVP7 депонированы в коллекции микроорганизмов под номерами B-5736 и B-5943, соответственно. Предложен специфичный сигнальный пептид - СП1073, активатор синтеза бактериоцина E1073, выделенный из среды культивирования штамма-продуцента бактериоцина E.faecium LVP 1073.

Предложен способ получения бактериоцина, заключающийся в совместном культивирования штамма-продуцента и штамма-индуктора в присутствии сигнального пептида на питательной среде низкой концентрации (5% МРС), что позволяет повысить продукцию бактериоцина, по сравнению с использованием только одного штамма-продуцента, в 6,7 раза (с 41,6 мг до 280 мг в 1 л КЖ). Очистку активной пептидной фракции из бесклеточного супернатанта КЖ проводят с помощью ионообменной хроматографии, используя смолу SP-Sepharose FF, и в последующем - хроматографию гидрофобного взаимодействия на смоле Octyl-Sepharose 4FF (Amersham Pharmacta Biotech, Швеция). Очищенный бактериоцин E1073 имеет молекулярную массу 3256 Да, состоит из 34 аминокислот и имеет ключевую последовательность YGNGV, которая подтверждает принадлежность его к бактериоцинам класса 2а. Его изоэлектрическая точка (pI) равна 8.2.

Бактериоцин Е1073 проявляет выраженную антагонистическую активность против многих грамположительных и грамотрицательных патогенов, включая грамположительные спороформирующие клостридии (C.perfringens), грамотрицательные кампилобактерии (C.jejuni) и сальмонеллы (S.Enteritidis).

Использование бактериоцина Е1073 для прижизненной предубойной обработки птицы будет способствовать получению тушек, свободных от патогенов и безопасных для человека, а также снижать содержание бактериальных патогенов в условиях, связанных с производством других экологически чистых продуктов питания.

Формула изобретения

1. Штамм Enterococcus faecium LVP 1073 депонирован в коллекции микроорганизмов Государственного научного центра прикладной микробиологии и биотехнологии, коллекционный номер В-5736 - продуцент бактериоцина Е1073 против бактериальных патогенов.

2. Бактериоцин Е1073 против бактериальных патогенов, продуцируемый штаммом Enterococcus faecium LVP 1073 по п.1, имеющий аминокислотную последовательность TSYVYGNGVKENIAGEVRKGWGSGVAWDVDWKLA.

3. Штамм Lactobacillus plantarum 1 LVP7 депонирован в коллекции микроорганизмов Государственного научного центра прикладной микробиологии и биотехнологии, коллекционный номер В-5943 - индуктор синтеза бактериоцина Е1073 по п.2.

4. Сигнальный пептид СП1073, синтезированный штаммом Enterococcus faecium LVP 1073 по п.1 - регулятор синтеза бактериоцина Е1073 по п.2, имеющий мол. массу 2,1 кДа и pI 8,1.

5. Способ получения бактериоцина E1073, включающий совместное культивирование штамма продуцента бактериоцина и штамма индуктора, добавление сигнального пептида, с последующим выделением бактериоцина из бесклеточного супернатанта и с поверхности клеток продуцента и индуктора, очисткой пептидной фракции хроматографией гидрофобного взаимодействия, а затем ионообменной хроматографией на Superose SP FE, отличающийся тем, что проводят культивирование штамма Enterococcus faecium LVP 1073 в течение 24 ч на среде МРС бульон 5% при температуре 37±1°С совместно с штаммом индуктором Lactobacillus plantarum 1 LVP7, с добавлением сигнального пептида СП1073 на 10 час роста культур в приемлемой концентрации, а очистку пептидной фракции проводят последовательно, сначала с использованием ионообменной хроматографии на SP-Sepharose FF, а затем хроматографии гидрофобного взаимодействия на Octyl-Sepharose 4FF, с последующим выделением целевого продукта в виде элюата.

6. Способ по п.5, отличающийся тем, что элюат содержит 25 mM TRIS HCl, 15 mM K₂HPO₄ и бактериоцин Е1073 в количестве, соответствующем его содержанию в культуральной жидкости.

Изобретение "ШТАММ ENTEROCOCCUS FAECIUM LVP1073, ПРОДУЦЕНТ БАКТЕРИОЦИНА ПРОТИВ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПАТОГЕНОВ, БАКТЕРИОЦИН E1073 ПРОТИВ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПАТОГЕНОВ, ШТАММ LACTOBACILLUS PLANTARUM 1 LVP7 - ИНДУКТОР СИНТЕЗА БАКТЕРИОЦИНА E1073, СИГНАЛЬНЫЙ ПЕПТИД СП1073 - РЕГУЛЯТОР СИНТЕЗА БАКТЕРИОЦИНА E1073, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИОЦИНА E1073" (Светоч Э.А., Перелыгин В.В., Ерусланов Б.В., Левчук В.П., Похиленко В.Д., Мицевич Е.В., Мицевич И.П., Лунева Н.И., Борзенков В.Н., Светоч О.Е., Дятлов И.А.) отмечено юбилейной наградой (25 лет Российской Академии Естествознания)
Медаль Альфреда Нобеля

Оформление наградных документов и заказ каталога