ШТАММ ENTERОCOCCUS MUNDTII, ПРОДУЦИРУЮЩИЙ СУБСТАНЦИЮ ПЕПТИДНОЙ ПРИРОДЫ С АНТИЛИСТЕРИОЗНОЙ АКТИВНОСТЬЮ

Название	ШТАММ ENTERОCOCCUS MUNDTII, ПРОДУЦИРУЮЩИЙ СУБСТАНЦИЮ ПЕПТИДНОЙ ПРИРОДЫ С АНТИЛИСТЕРИОЗНОЙ АКТИВНОСТЬЮ
Разработчик (Авторы)	Храмов В.М., Похиленко В.Д., Перелыгин В.В., Садикова Г.Т., Калмантаев Т.А., Чукина И.А., Светоч Э.А.
Вид объекта патентного права	Изобретение
Регистрационный номер	2532227
Дата регистрации	23.10.2013
Правообладатель	Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии

Описание изобретения

Изобретение относится к биотехнологии и может быть применено для получения антимикробной пептидной субстанции - бактериоцина, используемого при производстве продовольственных продуктов, с целью профилактики и лечения пищевых заболеваний, вызываемых бактериальными патогенами, особенно листериями.

Проблема антибиотикорезистентности, особенно борьба с возбудителями пищевых инфекций - консервантами, безопасными для человека, - актуальна.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

В последнее десятилетие внимание исследователей привлечено к бактериям из рода Enterococcus как потенциальных пробиотикам и продуцентам антимикробных субстанций пептидной природы, которые имеют высокий потенциал применения в производстве продуктов питания, кормов и биопрезервантов.

Несмотря на большое количество научных работ, выполненных в этом направлении и подтверждающих интерес к исследованиям такого рода, только единичные штаммы-продуценты бактериоцинов были доведены до практического использования (низин, педиоцин). Основные проблемы, с которыми сталкиваются разработчики на пути внедрения новых бактериоцинов, это безопасность штаммов-продуцентов и невысокий выход целевой продукции. Так, использование продуцентов бактериоцинов из рода Enterococcus в качестве пробиотиков вызывает настороженность: среди них встречаются штаммы, вызывающие заболевания человека и животных, а также штаммы носители генов резистентности к ванкомицину. У ряда штаммов этого рода выявлены такие факторы вирулентности, как адгезия к клеточным поверхностям, клеточная агрегация и конъюгация, гидролиз коллагена, гемоглобина, желатина (gelE), активация цитолизина, экспрессия адгезинов клеточной стенки (efaAfm). Эти факторы часто ассоциированы со штаммами вида Е. faecalis (Foulquié-Moreno et al., 2006; Mannu et al., 2003) - y некоторых из них выявили гены geIE, efaAfm, а также обнаружена резистентность к антибиотику ванкомицину (Eaton and Gasson, 2001).

Представители рода Enterососсus, применяемые в качестве продуцентов бактериоцинов типа энтероцинов, имеют хорошую перспективу в борьбе с бактериями, вызывающими порчу пищи и кишечные заболевания. Однако исследователями отмечаются невысокие выходы бактериоцинов, что ограничивает практическое использования представителей этого рода микроорганизмов.

Таким образом, поиск в окружающей среде более безопасных и в то же время более продуктивных штаммов энтерококков продуцентов бактериоцинов, которые способны быть альтернативой антибиотикам и химиопрепаратам, является актуальной задачей биотехнологии.

Известен штамм Enterococcus mundtii ST4SA (Patent US 8444998), который продуцирует пептид - бактериоцин ST4SA (м.в. 3400 Да), обладающий антимикробными свойствами, однако представленные авторами высокие значения бактерицидной активности препарата относятся лишь к чувствительному тестовому штамму лактобактерий - Lactobacillus casei LHS. Активность в отношении листерий оценена только для одного представителя этого рода - непатогенного штамма Listeria innocua LMG 13568.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является штамм Enterococcus faecium 1073, продуцирующий бактериоцин Е-1073 (м.в. 3256 Да), выделенный из кишечника бройлерного цыпленка, идентифицированный и исследованный в ГНЦ ПМБ. Этот штамм в условиях глубинного культивирования продуцировал в культуральную жидкость бактериоцин Е-1073 с активностью против L. monocytogenes на уровне 800-1600 АЕ/мл. Такой невысокий выход целевого продукта потребовал дополнительного использования специфических активаторов биосинтеза - конкурентных бактерий и сигнальных пептидов, что в целом усложняет технологию получения бактериоцинов.

Задачей настоящего изобретения является получение нового продуцента бактерицидной субстанции пептидной природы (бактериоцина) - представителя рода Enterососсus, обладающего более высоким выходом целевого продукта, антилистериозной активностью, не резистентного к ванкомицину и пригодного для снижения микробной обсемененности (деконтаминации) лабильных биопродуктов, а также материалов, инфицированных бактериальными патогенами.

Поставленная задача решается тем, что предложен штамм Enterococcus mundtii PPHS-5-13, продуцирующий субстанцию пептидной природы (бактериоцина) с антилистериозной активностью, не обладающий резистентностью к ванкомицину.

Штамм Enterococcus mundtii PPHS-5-13 депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ - Оболенск», регистрационный номер В-7424.

Штамм Enterococcus mundtii PPHS-5-13 выделен из молочного продукта (прогорклого молока).

Штамм Enterococcus mundtii PPHS-5-13 характеризуется следующими признаками:

Культурально - морфологические признаки

Штамм Enterococcus mundtii PPHS-5-13 неподвижен, колонии имеют окраску желтого цвета диаметром 1-1,5 мм, клетки штамма в мазках, окрашенных по Граму, имеют вид грамположительных «яйцевидных» кокков до 2 мкм в диаметре, каталазоотрицателен, растет в присутствии 2,5% хлористого натрия, в диапазоне температур от 10 до 45°С.Штамм негемолитичен, микроаэрофилл.

Биохимические признаки

Биохимические свойства определяли с использованием систем rapid ID API 32 STREP (Bio-Merieux, Франция). Гидролизует аргинин, с помощью глюкозидаз и галактозидаз расщепляют некоторые олигосахариды, но не раффинозу и сорбозу. Ферментирует рибозу, маннит, лактозу, сахарозу, мальтозу, тагатозу, трегалозу. Способен образовывать ацетилметилкарбинол из глюкозы, ферментировать пятиатомный спирт арабит, но не обладает уреазной активностью. Чувствителен к ванкомицину (ПДК - менее 4 мг/мл).

Штамм Enterococcus mundtii PPHS-5-13 продуцирует субстанцию пептидной природы - бактериоцин с антилистериозной активностью.

Исследования по идентификации выделенного нами штамма с использованием масс - спектрометра MALDI - TOF BioTyper (Microflex, Bruker Daltonik GmbH) дали достаточно высокие показатели уровня вероятности определения до уровня вида (2,300-2,500 или+++), которые позволили сделать заключение о его близости к музейному штамму из немецкой коллекции - Enterococcus mundtii 4840 DSM. Уточнение видовой принадлежности штамма на основе генетического типирования ДНК проводилось в ПЦР с праймерами, фланкирующими гены tuf, spacer 16S-13S rDNA, rpoA, gap.Ампликоны синтезированы с двумя парами праймеров: tuf и spacer 16S-13S rDNA. Секвенированная последовательность спейсера и последовательности, исследованные для ДНК изолированных колоний, совпали на протяжении 470 нуклеотидов в направлении от 23S rDNA. Сходство на уровне 97-98% для Е. mundtii АТСС 43186, определенное по программе BLAST, позволило уверенно отнести найденный штамм к виду Enterococcus mundtii.

Таким образом, на основании совокупности проведенных исследований патентуемый штамм отнесен к виду Enterococcus mundtii и депонирован как Enterococcus mundtii PPHS-5-13 (далее по тексту - штамм PPHS-5-13).

Выделенная из среды культивирования пептидная субстанция штамма PPHS-5-13 ингибирует рост 23 патогенных штаммов вида Listeria monocytogenes, а также подавляет в различной степени рост Acinetobacter lwoffii; Pseudomonas aeruginosa 468; Staphylococcus aureus 46; Klebsiella pneumoniae 114; Enterobacter cloacae 190; Salmonella enteritidis 237; Shigella sonne ½ и Campylobacter jejuni (коллекция ГНЦ ПМБ)

Штамм PPHS-5-13 не токсичен для белых мышей при пероральном скармливании каждой особи по 100 мг сухой культуры, иммобилизованной в гранулу коммерческого корма. Штамм сохраняет способность продуцировать бактериоцин в кишечнике и после повторного выделения его из фекальной массы мышей.

Предложен способ выращивания штамма PPHS-5-13 на плотных и жидких питательных средах на основе гидролизатов казеина или рыбной муки производства ГНЦ ПМБ с добавлением глюкозы или сахарозы, дрожжевого экстракта, цитрата, солей натрия, магния в ферментерах объемом до 100 литров при контролируемой температуре, рН и оптической плотности. Разделение клеток и получение бесклеточной жидкости, содержащей бактериоцин, проводится методом сепарирования в поле центробежных сил или мембранной фильтрации. Концентрирование бесклеточной жидкости (супернатанта-пермеата) осуществляется в два этапа: путем примерно 10-кратного упаривания на вакуумном роторном испарителе с последующим удалением водной фазы методом распылительного высушивания.

Извлечение активного начала (фракции бактериоцина) производится методом фазовой сепарации из регидратированного порошка супернатанта с использованием органического растворителя, что позволяет удалить до 96-98% (по массе) балластных компонентов. Наличие пептидной субстанции - бактериоцина в концентрате и оценка его активности и молекулярной массы определяются методом электрофореза в системе трицин-ДСН-полиакриламидный гель.

Пептидная природа субстанции бактериоцина подтверждается присутствием окрашенной Кумасси полоски на пластине геля, ее соответствия молекулярному маркеру и наличию зоны ингибирования листерий в месте расположения полоски. Пептидная природа подтверждается также полной потерей активности после обработки субстанции протеолитическими ферментами-химотрипсином и протеиназой K.

Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами:

Фиг.1 - Колония штамма PPHS-5-13 диаметром 2 мм дает зону 35 мм на газоне L. monocytogenes 776.

Фиг.2 - Биотестирование концентрата супернатанта штамма PPHS-5-13 (1) и активной фракции (2), элюированной из хроматографической колонки HPLS: электрофорез в системе трицин-ДСН-ПААГ, маркеры (М) Page Ruler от 3,4 до 100 кДа, агар инокулирован L. monocytogenes 776.

Формула изобретения

Штамм Enterococcus mundtii PPHS-5/13, продуцирующий субстанцию пептидной природы с антилистериозной активностью, депонированный в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур "ГКПМ - Оболенск", регистрационный номер В-7424.

Изобретение "ШТАММ ENTERОCOCCUS MUNDTII, ПРОДУЦИРУЮЩИЙ СУБСТАНЦИЮ ПЕПТИДНОЙ ПРИРОДЫ С АНТИЛИСТЕРИОЗНОЙ АКТИВНОСТЬЮ" (Храмов В.М., Похиленко В.Д., Перелыгин В.В., Садикова Г.Т., Калмантаев Т.А., Чукина И.А., Светоч Э.А.) отмечено юбилейной наградой (25 лет Российской Академии Естествознания)
Медаль Альфреда Нобеля

Оформление наградных документов и заказ каталога