СРЕДСТВО ДЛЯ НОРМАЛИЗАЦИИ КОЛИЧЕСТВА CD4+ Т-ЛИМФОЦИТОВ ПРИ ЛИМФОСАРКОМЕ ПЛИССА

Название	СРЕДСТВО ДЛЯ НОРМАЛИЗАЦИИ КОЛИЧЕСТВА CD4+ Т-ЛИМФОЦИТОВ ПРИ ЛИМФОСАРКОМЕ ПЛИССА
Разработчик (Авторы)	Новиков Виктор Владимирович, Солопаева Инесса Михайловна, Иванова Нина Леонидовна, Аксенова Татьяна Владимировна
Вид объекта патентного права	Изобретение
Регистрационный номер	2316338
Дата регистрации	10.02.2008
Правообладатель	Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Нижегородская государственная медицинская академия Росздрава" (ГОУ ВПО "НижГМА Росздрава")
Область применения (класс МПК)	A61K 38/24 (2006.01) A61P 35/00 (2006.01)

Описание изобретения

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии и иммунологии, и может быть использовано для нормализации количества CD4+ Т-лимфоцитов при лимфосаркоме Плисса.

Несмотря на значительные успехи в диагностике и терапии злокачественных опухолей результаты лечения онкологических больных продолжают оставаться недостаточно удовлетворительными. Учитывая значение иммунологических механизмов в противоопухолевом лечении и то, что известные методы противоопухолевой терапии оказывают неблагоприятное действие на систему иммунитета, в настоящее время важным и актуальным является поиск и внедрение эффективных иммунофармацевтических препаратов с целью усиления различных звеньев противоопухолевого иммунитета.

При ряде онкологических заболеваний обнаружено достоверное снижение CD4+ Т-лимфоцитов. Например, у больных с саркомой Капоши на фоне выраженной ВИЧ-инфекции (1), у больных раком яичников на поздних стадиях заболевания (2) и у больных раком молочных желез (3), причем снижение относительного количества CD4+ Т-лимфоцитов рассматривается как свидетельство иммунодепрессии, способствующей быстрому росту опухоли, в том числе и саркомы Плисса.

Приведенные данные говорят об актуальности поисков препаратов, способствующих коррекции дефицита CD4+ Т-лимфоцитов при различных злокачественных опухолях.

ХГ по современным представлениям является иммуномодулятором и применяется в качестве средства для лечения некоторых злокачественных опухолей. Так, опубликованы сведения о том, что при кратковременном применении экстракта трофобласта человека, содержащего ХГ в большом количестве, получен стойкий клинический эффект у больных с плоскоклеточным раком легкого при наличии метастазов после нерадикального хирургического удаления опухоли. (4). Оказалось, что введение ХГ и его бета-субъединицы или биологически активных фрагментов ХГ или его бета-субъединицы дает положительный эффект при лечении карциномы молочных желез, простаты, яичников, а также при нейробластоме и саркоме Капоши (5). У больных острой миэлоидной лейкемией после введения ХГ в комплексе с левомизолом отмечали снижение количества бластных форм клеток в костном мозгу и периферической крови без прогрессивного увеличения их в течение 70-121 дня (6). Кроме того, показано, что введение низкой концентрации коммерческого препарата ХГ, а также синтетического полипептидного фрагмента бета-субъединицы ХГ, состоящей из 18-ти аминокислотных остатков (с 125 по 145), тормозит рост лейкемоидной клеточной линии HL-60 (7).

При раке яичников у больных изучали влияние на систему иммунитета адаптогенов растительного происхождения (2). Применяемые в онкологии методы лечения для больных раком яичников, это, как правило, операция и химиотерапия, оказывают в основном неблагоприятное воздействие на систему иммунитета. Еще более значительные нарушения иммунологической реактивности обнаруживаются у больных раком яичников при проявлении рецидива заболевания. В связи с этим очевидна необходимость коррекции состояния иммунитета в процессе лечения больных раком яичников.

В данном источнике изучали влияние экстракта элеуторококка, настойки женьшеня, китайского лимонника, аралии, родиолы розовой, полисахаридов из гриба Gunaderma Lucidum на состояние иммунной системы у больных раком яичников. Экстракт родиолы розовой принимали больные, леченые по схеме - операция + химиотерапия. У больных, которые в период химиотерапии принимали экстракт родиолы розовой, увеличивалось количество Т-лимфоцитов, CD4+ Т-лимфоцитов, NK-lisis клеток. На основании приведенных данных на рис. 2 количество CD4+ Т-лимфоцитов в периферической крови в группе больных с рецидивом заболевания, которые в период химиотерапии принимали экстракт родиолы розовой, увеличилось на 47% по сравнению с содержанием у первичных больных и на 19% по сравнению с больными с рецидивом заболевания до лечения. Согласно таблице 4, у больных, получавших на фоне химиотерапии экстракт элеутороккока, количество CD4+ Т-лимфоцитов в периферической крови увеличилось на 30% в сравнении с содержанием этих клеток до лечения. Данные о влиянии на CD4+ Т-лимфоциты других указанных в работе адаптогенов в статье (2) не приводятся.

Однако из этих известных публикаций с очевидностью для специалиста не вытекает возможность использования ХГ в качестве средства нормализации CD4+ Т-лимфоцитов в периферической крови онкологических больных, т.к. сведений о влиянии ХГ на динамику этих клеток в указанных исследованиях не приводится.

Влияние хорионического гонадотропина на количество CD4+ Т-лимфоцитов при онкозависимом иммунодефиците, в том числе и при лимфосаркоме Плисса, не известно.

Задачей предлагаемого изобретения является:

- повышение эффективности за счет обеспечения нормализации количества CD4+ Т- лимфоцитов при лимфосаркоме Плисса;

- расширение арсенала средств для коррекции онкозависимого иммунодефицита.

Для достижения поставленной задачи используется применение гормона хорионического гонадотропина в качестве средства для нормализации количества CD4+ Т-лимфоцитов при лимфосаркоме Плисса.

Эксперимент выполнен на экспериментальных животных - самцах белых беспородных крыс с массой тела 180-200 г.

В качестве модели онкопатологии использовалась лимфосаркома Плисса, которая является истинно злокачественной опухолью и переносится от одной крысы к другой путем перевивки гомогената основного узла в подкожную клетчатку. На месте перевивки развивается, как правило, узел, прогрессивно быстро увеличивающийся и инфильтрирующий окружающие ткани, некоторые внутренние органы и дающий метастазы. Все животные с лимфосаркомой Плисса погибают в среднем через 30-40 дней после перевивки. Кроме того, эта опухоль представлена как модель для анализа противоопухолевой активности различных препаратов (8).

Перевивку лимфосаркомы Плисса производили путем ведения в правый бок животного подкожно 1 мл профильтрованной без крупных кусочков опухолевой взвеси, приготовленной на физиологическом растворе. Коммерческий препарат ХГ в дозе 150 ЕД вводили подкожно однократно в левый бок на третьи сутки после перевивки опухоли. Доза эта была выбрана потому, что в предыдущих исследованиях было показано, что доза 150 ЕД является терапевтической для лечения патологически измененных органов у крыс с массой тела 180-200 г (9).

Животных забивали декапитацией на 10-е сутки после перевивки, потому что к этому времени лимфосаркома Плисса достигала значительных размеров, но в ней еще не было значительно выраженного некроза, который нередко сопровождается изъязвлением кожных покровов в области расположения опухоли и развитием метастазов.

Крысы были разделены на 3 группы:

1-ая группа - 10 интактных крыс (№№1-10); 2-ая группа - 10 крыс с опухолью Плисса, не получавших гормон (№№11-20); 3-я группа - 10 крыс с опухолью Плисса получали гормон в дозе 150 ЕД (№№21-30).

Состояние иммунной системы у животных определяли по изменению количества мононуклеарных клеток, имеющих на своей поверхности CD4 антиген. Изменение популяционного состава CD4+ Т- лимфоцитов периферической крови оценивали методом непрямой флуоресценции с помощью моноклональных антител ИКО-101 против CD4 антигена крыс (10).

Была исследована кровь у 30 крыс. В каждом препарате моноклональных клеток крови просчитывали 200-300 клеток.

Для выделения CD4+ Т-лимфоцитов в периферической крови 5 мл гепаринизированной крови (5 ЕД/мл) разводили забуференным физиологическим раствором (ЗФР) рН 7,4 в соотношении 1:1, наслаивали на 3 мл фиколлтразографиновой смеси плотностью 1,077 мг/мл. После этого кровь центрифугировали при 1,5 тыс. оборотов 30-40 минут при комнатной температуре. После центрифугирования полученное мутноватое кольцо мононуклеарных клеток осторожно снимали пипеткой и помещали в пробирку, где объем полученной суспензии клеток с помощью ЗФР доводили до 10 мл и центрифугировали при 1,5 тыс. оборотов 10 минут. Таким образом клетки отмывали дважды. Клетки выделяли не позднее двух часов после забора крови.

Для проведения реакции непрямой иммуннофлюоресценции суспезию исследуемых клеток объемом 20-50 мкл (концентрация 2-3×106 клеток/мл) наносили в лунку - отверстие в парафилме, предварительно наплавленном на предметное стекло, а затем инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре во влажной камере. Из лунок отсасывали ЗФР и добавляли по 20-30 мкл раствора моноклональных антител ИКО-101. После инкубации в течение 60 минут при 37°С клетки отмывали 5 раз в гистологических стаканчиках ЗФР (рН 7,4) или раствором Хенкса. В отмытые лунки наносили по 20-50 мкл рабочего раствора фрагментов антител против иммуноглобулинов мыши, меченых флюоресцеинизотиоцианатом. Затем инкубировали 30 минут в холодильнике при температуре +4°С.

Отмывали клетки 5 раз ЗФР или раствором Хенкса. Вносили в лунки 50%-ный раствор глицерина на физиологическом растворе и сразу производили подсчет антигенположительных клеток при длине волны излучения 495 нм и эмиссии 525 нм.

Подсчитывали число светящихся по периферии лимфоцитов на 100 клеток.

Статистическую обработку проводили с использованием компьютерной программы Excel.

Результаты исследования приведены в таблице 1.

Результаты исследования, приведенные в таблице 1, свидетельствуют о том, что при опухоленосительстве у крыс 2-ой группы через 10 дней после перевивки опухоли происходило достоверное в 3,7 раза снижение количества CD4+ Т-лимфоцитов периферической крови в сравнении с содержанием этих клеток у животных интактной группы. Следовательно, в процессе роста трасплантированной лимфосаркомы Плисса у животных развивался относительный дефицит Т-клеточной системы иммунитета.

Содержание CD4+ Т-лимфоцитов в периферической крови животных 3-ей группы, получавших гормон в дозе 150 ЕД, ко времени забоя достоверно увеличивалось в 3,2 раза по сравнению с содержанием этих клеток у крыс с лимфосаркомой Плисса, не получавших ХГ, и достоверно не различалось с количеством этих клеток в периферической крови интактных животных.

Следовательно, после одноразового введения коммерческого препарата ХГ в дозе 150 ЕД количество CD4+ Т-лимфоцитов у крыс 3-ей группы ко времени забоя животных нормализовалось.

Приведенные данные говорят о том, что под влиянием коммерческого препарата ХГ в дозе 150 ЕД произошла нормализация количества CD4+ Т-лимфоцитов у крыс с лимфосаркомой Плисса

ПРИМЕРЫ.

Пример №1, иллюстрирующий содержание CD4+ Т-лимфоцитов у крысы с лимфосаркомой Плисса, не получавшей ХГ. Крысе №11 26 июня перевита лимфосаркома Плисса. Перевивку делали путем введения 1 мл профильрованной взвеси клеток опухоли в физиологическом растворе подкожно в правый бок. Через 10 дней после перевивки крысу забили декапитацией. При забое забирали для исследования периферическую кровь.

Для выделения CD4+ Т-лимфоцитов в периферической крови гепаринизированную (5 ЕД гепарина/мл) полученную при забое кровь крысы №11 в количестве 5 мл разводили забуференным физиологическим раствором (ЗФР) рН 7,4 в соотношении 1:1 и наслаивали на 3 мл фиколлтразографиновой смеси плотностью 1,077 мг/мл. После этого кровь центрифугировали при 1,5 тыс. оборотов 30-40 минут при комнатной температуре. После центрифугирования полученное мутноватое кольцо мононуклеарных клеток осторожно снимали пипеткой и помещали в пробирку, где объем полученной суспензии клеток доводили с помощью ЗФР до 10 мл и центрифугировали при 1,5 тыс. оборотов 10 минут. Таким образом клетки отмывали ЗФР дважды. Клетки выделяли не позднее двух часов после забора крови.

Для проведения реакции непрямой иммуофлюоресценции суспезию исследуемых клеток объемом 20-50 мкл (концентрация 2-3×106 клеток /мл) наносили в лунку-отверстие в парафилме, предварительно наплавленном на предметное стекло, а затем инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре во влажной камере. Из лунок отсасывали ЗФР и добавляли по 20-50 мкл раствора моноклональных антител ИКО-101. После инкубации в течение 1 часа при температуре 37°С клетки отмывали 5 раз в гистологических стаканчиках ЗФР (рН 7,4) или раствором Хенкса. В отмытые лунки наносили по 30-50 мкл рабочего раствора фрагментов антител против иммуноглобулинов мыши, меченых флюоресцеинизотиоцианатом. Затем инкубировали 30 минут в холодильнике при температуре +4°С. Отмывали клетки 5 раз ЗФР или раствором Хенкса. Вносили в лунки 50%-ный раствор глицерина на физиологическом растворе и сразу производили подсчет антигенположительных клеток при длине волны излучения 495 нм и эмиссии 525 нм.

Подсчитывали число светящихся лимфоцитов на 100 клеток.

Статистическую обработку данных проводили с использованием компьютерной программы Excel.

Количество CD4+ Т-лимфоцитов в периферической крови у крысы №11 оказалось равным 9%, что свидетельствует о выраженном онкоиммунодефиците по данному показателю у этого животного.

Пример №2 иллюстрирует влияние ХГ на содержание CD4+ Т-лимфоцитов в периферической крови, полученной при забое животного. Крысе №28 26-го июня перевита лимфосаркома Плисса. Перевивку делали путем введения 1 мл профильтованной взвеси клеток опухоли в физиологическом растворе подкожно в правый бок. Через 3 суток после перевивки опухоли крысе №28 ввели подкожно в левый бок препарат ХГ в дозе 150 БД на животное, через 10 дней после перевивки крысу забили декапитацией. При забое для исследования забирали периферическую кровь.

Описание методов выделения мононуклеарных клеток периферической крови и непрямой иммунофлюоресценции см. в описании примера №1.

Содержание CD4+ Т-лимфоцитов в периферической крови у крысы №28 оказалось равным 39%, что свидетельствует о нормализации этого показателя у данного животного.

Пример №3. Крыса №3 относится к группе интактного контроля. Ей не делали перевивку лимфосакомы Плисса. При забое этой крысы декапитацией у нее взяли для исследования периферическую кровь.

Описание методов выделения мононуклеарных клеток периферической крови и непрямой иммунофлюоресценции см. в описании примера №1.

Количество CD4+ Т-лимфоцитов в периферической крови у крысы №3 было равным 41%, что свидетельствует о нормальном содержании этих клеток у этого животного.

Источники информации

1. Кравченко А.В., Полякова A.M., Серебровская Л.В. и соавт. // Эпидемиология и инфек. болезни. 1997. С.40-44.

2. Зарядьева А.В. Москалев Е.Ю. // Вести. Онкол. Научного центра им. Н.Н.Блохина. 1998. №4. С.58-62.

3. Балуева И.А., Семиглазов В.Ф. // Вопросы онкологии. 1996. Т.42. №3. С.31-34.

4. Говалло В.Т., Дубровский А.В.Длительное наблюдение больных раком легкого с метастазами после операции и иммунологического лечения. // Вопросы онкологии. 1981. - Т.27. - №6. - С.69-73.

5. United States Patent №5,877,148. Date of Patent: Mar 2, 1999 «Treatment of Cancer with human chorionic Gonadotropin» Inventors: Yanto Lunardi-Iskandar, Robert C. Collo, Joseph L. Bryant.

6. Feldman T.J., Sener R., Chio S.N. et al. // Leukemia/1998/ Nov/12 (11).

7. Валуйских А.Н., Ромашкова Ю.А., Данилевич А.И. и соавт. // Бюлл. экспер. биол. и мед. 1997. №4. С.424-426.

8. Патент РФ №189589 от 23.08.1993. «Средство для определения противоопухолевой активности».

9. Солопаева И.М. Хорионический гонадотропин в биологии и медицине. Изд-во Нижегородского госуниверситета им. Н.И.Лобачевского. Нижний Новгород: 2000. - 191 с.

10. Сандова О.М., Фролова Е.А., Барышникова А.Ю., Новиков В.В. // Иммунология, 1996. №6. С.39-41.

Формула изобретения

Применение гормона хорионического гонадотропина в качестве средства для нормализации количества CD4+ Т-лимфоцитов при лимфосаркоме Плисса.

Изобретение "СРЕДСТВО ДЛЯ НОРМАЛИЗАЦИИ КОЛИЧЕСТВА CD4+ Т-ЛИМФОЦИТОВ ПРИ ЛИМФОСАРКОМЕ ПЛИССА" (Новиков Виктор Владимирович, Солопаева Инесса Михайловна, Иванова Нина Леонидовна, Аксенова Татьяна Владимировна) отмечено юбилейной наградой (25 лет Российской Академии Естествознания)
Медаль Альфреда Нобеля

Оформление наградных документов и заказ каталога