L международная выставка-презентация
научных, технических, учебно-методических и литературно-художественных изданий
БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЙ КОМПЛЕКС НА ОСНОВЕ БЕСКЛЕТОЧНОГО ПРОБИОТИКА, КОРМОВАЯ КОМПОЗИЦИЯ ЕГО СОДЕРЖАЩАЯ, И СПОСОБ КОРМЛЕНИЯ МОЛОДНЯКА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ И ПТИЦЫ
| Название | БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЙ КОМПЛЕКС НА ОСНОВЕ БЕСКЛЕТОЧНОГО ПРОБИОТИКА, КОРМОВАЯ КОМПОЗИЦИЯ ЕГО СОДЕРЖАЩАЯ, И СПОСОБ КОРМЛЕНИЯ МОЛОДНЯКА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ И ПТИЦЫ |
|---|---|
| Разработчик (Авторы) | Самуйленко А.Я., Неминущая Л.А., Провоторова О.В., Бобровская И.В., Еремец Н.К., Воробьёва Г.И., Скотникова Т.А., Гринь С.А., Иванов А.В., Красочко П.А., Усов С.М., Красочко П.П., Еремец В.И. |
| Вид объекта патентного права | Изобретение |
| Регистрационный номер | 2538116 |
| Дата регистрации | 10.01.2015 |
| Правообладатель | Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности РАСХН |
| Область применения (класс МПК) | A23K 1/16 (2006.01) |
Описание изобретения
Изобретение относится к сельскому хозяйству и биотехнологии, в частности к изготовлению биологически активных добавок для сельскохозяйственных животных и птицы. Биологически активный комплекс в качестве бесклеточного пробиотика содержит смесь стерильных культуральных жидкостей бактерий Lactobacillus plantarum штамм 8 РАЗ (ВКПМ № В-11007) и Bacillus subtilis штамм М-8 (ВКПМ № В-1948), взятых в объемном соотношении 1:1, в качестве пребиотика - жидкий стерильный автолизат мицелия гриба Fusarium sambucinum штамм MKF-2001-3 (ВКПМ № F-867), а в качестве сухой биологически активной добавки - сухую биомассу гриба Fusarium sambucinum штамм MKF-2001-3 (ВКПМ № F-867). Комплекс применяется без предварительного смешивания пробиотика, пребиотика и/или биологически активной добавки, каждый компонент непосредственно вносятся в корм или питьевую воду в дозах, зависящих от вида и возраста животных. Изобретение позволяет повысить продуктивность животных, естественную резистентность организма, компенсировать в рационах кормления животных и птицы дефицит аминокислот, витаминов, микроэлементов, повысить усвояемость кормов, нормализовать микрофлору желудочно-кишечного тракта. 6 н. и 9 з.п. ф-лы, 19 табл., 9 пр.
Изобретение относится к биотехнологии и сельскому хозяйству, в частности к изготовлению биологически активных добавок для сельскохозяйственных животных и птицы, и может быть использовано при их выращивании для повышения продуктивности, естественной резистентности, а также профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний.
Современное промышленное животноводство и птицеводство основано на применении высокоинтенсивных технологий содержания высокопродуктивных пород животных и кроссов птицы, что приводит к повышенной чувствительности к стрессам и нарушениям в режимах кормления и содержания, низкой иммунокомпетентности, значительному усилению техногенной и микробиологической нагрузки на организм животного и является основной причиной отхода молодняка и потери продуктивности взрослых животных от дисбактериоза, вирусных болезней и микст-инфекций.
В сложившейся ситуации необходимо качественное изменение характера кормовой базы за счет создания и применения экологически безопасных и эффективных биологически активных кормовых добавок, обладающих питательной ценностью и защитным действием на организм животных и птицы, что обусловило интенсивное развитие такого направления экобиотехнологии, как разработка и использование в ветеринарии пробиотиков, пребиотиков и синбиотиков.
Пробиотики - это живые микроорганизмы и микробные метаболиты, оказывающие при естественном способе введения позитивные эффекты на физиологические, биохимические и иммунные реакции организма хозяина путем стабилизации и оптимизации функции его нормальной микрофлоры.
Пребиотики - это препараты немикробного происхождения, способные оказывать позитивный эффект на организм хозяина через селективную стимуляцию роста или усиление метаболической активности нормальной микрофлоры кишечника.
Синбиотики - это препараты, полученные в результате рациональной комбинации пробиотиков и пребиотиков. Как правило, это биологически активные добавки, обогащенные одним или несколькими штаммами представителей бактерий-пробиотиков.
Синбиотики - это научно обоснованный комплекс про- и пребиотиков. Номенклатура синбиотиков для промышленного животноводства и птицеводства представлена как комплексными препаратами (сочетанием в одном препарате пробиотика и пребиотика), так и комплексами, состоящими из отдельных препаратов пробиотиков и пребиотиков, в которых синбиотические свойства обеспечиваются как составом комплекса, так и способом его применения.
Известен кисломолочный продукт, полученный культивированием в молоке штамма Bifidumbacterium sieccum №791, в который дополнительно вводят культуру Lactobacterium sieccum (plantarum). Данный способ предусматривает скармливание цыплятам вместе с кормом этого кисломолочного продукта с 4-го дня жизни по 4-6 мл на голову в начале кормления (Патент RU №2156062, А01К 67/02, опубл. 20.09.2000).
Недостатком известного аналога является нестабильность кисломолочного продукта и недостаточная его эффективность, т.к. бифидобактерии быстро теряют жизнеспособность.
Известен пробиотик для птиц «Авилакт-1К», который содержит высушенную сублимационным методом культуру штамма Lactobacillus acidophilum 1-К, выделенного из организма птицы. Способ выращивания птицы, предусматривающий добавление в корм пробиотика «Авилакт-1К» в количестве двух процентов от суточной нормы корма, начиная с суточного возраста птицы двумя курсами - с первого по десятый и с двадцатого по тридцатый дни (С.В.Калугин и др. Отработка технологических процессов изготовления и контроля пробиотика «Авилакт-1К» //Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов. ВНИИТИБП, Сборник докладов Международной конференции молодых ученых, 5-6 июня 2001 г., Щелково, 2001, с.88-91).
Известная кормовая добавка содержит только молочнокислые бактерии, что ограничивает спектр пробиотического действия, и не обогащена биологически активными веществами.
Известен пробиотический препарат для жвачных животных и способ его получения (Патент RU №2260043, C12N 1/20, А61К 35/74, опубл. 10.09.2005). Препарат представляет собой консорциум штаммов Clostridium cellobioparum КЭ-157, Ruminoccocus flavefaciens К-339, Lactobacillus acidophilus 1082 и Propionibacterium acnes-83, полученный при совместном культивировании, высушенный в защитной среде и смешанный с наполнителем.
Недостатком такого препарата является его относительно невысокая биологическая активность, связанная с процессом дезактивации живых микроорганизмов при их прохождении через верхние отделы желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), а также отсутствие стабильности их биологических свойств при длительном хранении, что ведет к снижению эффективности его применения.
Известен пробиотический препарат, предназначенный для повышения прироста живой массы поросят-отъемышей, и способ их кормления (Патент RU №2399661, C12N 1/20, А23К 1/16, опубл. 20.09.2010). Препарат представляет собой смесь культуральных жидкостей (КЖ) бактерий Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis (в соотношении 1:1), высушенную после внесения в них равного по массе количества смеси отрубей и гороховой муки (в соотношении 1:1).
Недостатком такого препарата является чувствительность входящих в его состав штаммов бактерий к антибиотикам, что снижает эффективность его применения одновременно с антибиотикотерапией.
Известен штамм гриба Fusarium sambucinum MKF 2001 - 3 (ВКПМ №F -867), используемый в качестве продуцента белка пищевого и кормового назначения и физиологически активных веществ (Патент РФ №2259209, А61К 35/84, A23L 1/054, C12N 1/14, C12N 1/14, C12R 1/77, опубл. 27.08.2005). На основе культуральной жидкости гриба разработан пребиотик АВИСТИМ (Неминущая Л.А. и др. Новый штамм гриба Fusarium sambucinum - продуцента биологически активных добавок // Научн. основы производства вет. биол. препаратов: мат. Междун. конф.- Щелково, 2005.- С.517-521).
Недостатком такого препарата является отсутствие пробиотической (антагонистической) активности и низкая питательная ценность в случае использования его в качестве кормовой добавки.
Известна кормовая добавка «Селебен», (Патент RU №2432774, А23К 1/00, опубл. 10.11.2010). Препарат включает диацетофенонилселенид и бентонит в различных сочетаниях.
Недостатком такого препарата является химическая природа одного из его компонентов (диацетофенонилселенида), а также неэффективность в отношении лечения и профилактики болезней ЖКТ, вызванных патогенными и условно-патогенными микроорганизмами, за счет отсутствия пробиотических бактерий.
Наиболее близким из аналогов по технической сущности и заявляемому эффекту является кормовая добавка для птицеводства (Патент RU №2286066, А23К 1/16, А23К 1/165, опубл. 27.10.2006), содержащая комплекс биологически активных веществ, продуцируемый грибами рода Fusarium, отличающаяся тем, что в качестве комплекса биологически активных веществ она содержит биомассу и/или культуральную жидкость, полученную при культивировании гриба Fusarium sambucinum штамма MKF 2001 - 3 (ВКПМ №F-867), или биомассу и/или культуральную жидкость, полученную при культивировании гриба Fusarium sambucinum штамма MKF 2001 - 3 (ВКПМ №F-867), в смеси с пробиотиком Авилакт-1К. Данное изобретение принято за прототип.
Недостатком прототипа является использование в его составе живых микроорганизмов, что не обеспечивает высокую биологическую активность за счет дезактивации при их прохождении через верхние отделы желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) животных с многокамерным строением желудка (например, крупный рогатый скот), а также затрудняет или исключает его использование совместно с антибиотиками за счет чувствительности штамма лактобактерий к антибиотикам. Недостатком является также низкая питательная ценность культуральной жидкости, полученной при культивировании гриба Fusarium sambucinum штамма MKF 2001 - 3 (ВКПМ №F-867), в случае использования ее в качестве кормовой добавки.
Задачей, решаемой авторами, является создание эффективной и экономичной кормовой добавки на основе синбиотического комплекса, включающего биомассу и/или автолизат гриба и бесклеточный пробиотик для повышения питательной ценности корма и обеспечения защитного действия предлагаемой добавки на организм животных и птицы.
Указанная задача решалась путем создания биологически активного комплекса, содержащего бесклеточный пробиотик (смесь стерильных культуральных жидкостей бактерий Lactobacillus plantarum штамм 8 РАЗ и Bacillus subtilis штамм М-8), пребиотик (жидкий стерильный автолизат мицелия гриба Fusarium sambucinum штамм MKF-2001-3) и/или сухую биологически активную добавку (сухая биомасса гриба Fusarium sambucinum штамм MKF-2001-3), а также создания на их основе кормовых композиций: сочетание пробиотика и пребиотика, сочетание пробиотика и биологически активной добавки, которые применяли молодняку сельскохозяйственных животных и птице без предварительного смешивания полученных препаратов, а способом непосредственного внесения каждого препарата в корм или питьевую воду в дозах, зависящих от вида и возраста животных.
Технический результат изобретения заключается в повышении продуктивности, физиологического и иммунного статуса организма животных и птицы, компенсации в рационе кормления дефицита аминокислот, витаминов и микроэлементов, повышении эффективности профилактики и лечения заболеваний ЖКТ, в том числе одновременно с применением антибиотиков, за счет применения молодняку крупного рогатого скота, свиней и птице кормовых композиций на основе разработанного биологически активного (синбиотического) комплекса, включающего бесклеточный пробиотик (смесь стерильных культуральных жидкостей бактерий Lactobacillus plantarum штамм 8 РАЗ и Bacillus subtilis штамм М-8), пребиотик (жидкий стерильный автолизат мицелия гриба Fusarium sambucinum штамм MKF-2001-3) и/или сухую биологически активную добавку (сухая биомасса гриба Fusarium sambucinum штамм MKF-2001-3). Данный результат достигается усилением полезных свойств препаратов (пробиотик и пребиотик, пробиотик и биологически активная добавка), при их совместном применении молодняку сельскохозяйственных животных и птице без предварительного смешивания препаратов, а способом непосредственного внесения каждого препарата в корм или питьевую воду в дозах, зависящих от вида и возраста животных.
Характеристика, получение и свойства препарата-пробиотика. Бесклеточный пробиотический препарат представляет собой смесь культуральных жидкостей (КЖ) лактобактерий Lactobacillus plantarum, штамм 8 РАЗ (ВКПМ №В-11007) и бактерий Bacillus, штамм М-8 (ВКПМ №В-1948), взятых в объемном соотношении 1:1. Культуральные жидкости включают метаболиты, накопленные методом раздельного глубинного культивирования бактерий на питательных средах, с последующим отделением микроорганизмов путем двухстадийной фильтрации на пористом многослойном керамическом фильтре для осветления и фильтровальной установке типа «Миллипор» (мембрана с размером пор 0,2 мкм) для стерилизации препарата (Пример 1). Качество полученного препарата характеризуют по показателям, приведенным в таблице 1.
В механизме действия пробиотических микроорганизмов большое значение имеет подавление роста патогенной и условно-патогенной микрофлоры. При введении бесклеточных пробиотических препаратов в ЖКТ также происходит торможение патогенной микрофлоры.
| Таблица 1 | |
| Биологические, органолептические и физико-химические свойства бесклеточного пробиотического препарата | |
| Внешний вид | Прозрачная или опалесцирующая жидкость желто-коричневого цвета. Допускается образование при хранении осадка из компонентов среды |
| Запах | Специфический, уксусной и молочной кислот |
| Посторонние включения | Не допускаются |
| Количество жизнеспособных клеток в 1 см3, не более | 1×105 |
| Наличие посторонних микроорганизмов в 1 см3 | Не допускается |
| рН | 5,0-6,0 |
| Биологическая (антагонистическая) активность, мм | Не менее 16 |
| Безвредность | Введение белым мышам препарата в тест-дозе 0,25 мл внутрь не должно вызывать изменений общего состояния животных в течение 10 дней |
Культуральные жидкости отобранных штаммов бактерий эффективно ингибируют рост патогенных бактерий родов Salmonella, Streptococcus, Staphylococcus, Proteus, Klebsiella, Pasterella и патогенных серотипов E.coli. Сочетание в одном препарате метаболитов кислотообразующих бактерий нормальной микрофлоры (Lactobacillus plantarum) и спорообразующих бактерий (Bacillus subtilis) позволяет сочетать механизмы действия и тех, и других.
В опытах in vitro определена биологическая (антагонистическая) активность (АА) препарата в отношении патогенных микроорганизмов ЖКТ (табл.а 2).
| Таблица 2 | ||
| Результаты определения антагонистической активности бесклеточного пробиотического препарата (n=10) | ||
| Патогенные микроорганизмы | зона задержки роста, мм | |
| экспериментальные данные | среднее | |
| S. typhimurium | 21; 24; 21; 24; 25; 22; 23; 25; 24; 22 | 23,1 |
| S. dublin | 19; 18; 19; 17; 19; 18; 19; 20; 17; 19 | 18,5 |
| S. gallinarum | 21; 24; 25; 25; 23; 24; 22; 24; 25; 21 | 23,4 |
| E.coli: K-88 | 18; 19; 20; 19; 18; 21; 22; 19; 18; 20 | 19,4 |
| E.coli: K-99 | 18; 20; 19; 18; 17; 19; 20; 18; 17; 20 | 18,6 |
| E.coli: A-20 | 16; 14;15; 16; 14; 16; 17; 17; 16; 17 | 15,8 |
Показано, что препарат обладает выраженным антагонизмом в отношении патогенных микроорганизмов ЖКТ.
Исследована антагонистическая активность бесклеточного пробиотика в отношении микроорганизмов, выделенных от больных послеродовыми эндометритами коров (таблица 3).
| Таблица 3 | ||||||
| Антагонистическая активность бесклеточного пробиотического препарата в отношении микроорганизмов, выделенных от больных послеродовыми эндометритами коров | ||||||
| Серия препарата | Диаметр зоны задержки роста (мм) | |||||
| Staph, epidermidis | Proteus vulgaris | E.coli | Staph, pyogenes | Staph, aureus | Ps. auroginosa | |
| №1 | 25 | 18 | 16 | 11 | 28 | 17 |
| №2 | 21 | 22 | 15 | 19 | 21 | 22 |
| №3 | 19 | 20 | 20 | 17 | 25 | 28 |
| №4 | 22 | 26 | 22 | 22 | 20 | 11 |
| №5 | 23 | 29 | 18 | 21 | 28 | 19 |
| №6 | 19 | 31 | 19 | 18 | 30 | 29 |
| №7 | 29 | 25 | 26 | 28 | 32 | 31 |
| М±m | 21,8 | 24,4 | 17,7 | 19,5 | 26,3 | 22,5 |
Полученные результаты свидетельствуют, что большинство штаммов микроорганизмов, выделенных от больных послеродовыми эндометритами коров, чувствительны к бесклеточному пробиотическому препарату.
Характеристика, получение и свойства пребиотика и биологически активной добавки на основе гриба Fusarium sambucinum, шт.MKF 2001 - 3 (ВКПМШ-867).
Для разработки пребиотика и биологически активной добавки в качестве продуцента БАВ использован штамм гриба Fusarium sambucinum MKF-2001-3 (патент РФ №2259209 «Штамм гриба Fusarium sambucinum - продуцент биологически активных веществ», опубл. 27.08.2005, Бюл. №24).
Пребиотик представляет собой стерильный жидкий автолизат мицелия гриба (AM), полученного при культивировании данного штамма в питательной среде на основе молочной сыворотки, последующего водного автолиза ее в культуральной жидкости, отделения биомассы на нутч-фильтрах и стерилизации фильтрата ультрафильтрацией на полых волокнах (Пример 2).
Биологически активная добавка представляет собой сухую биомассу гриба (БМ), полученную после отделения автолизата и высушенную распылительным способом (Пример 3).
Проведено сравнительное исследование химического состава биомассы (БМ), автолизата мицелия (AM) и культуральной жидкости (КЖ) по показателям: общий анализ (сухие вещества, общий белок, жиры, углеводы), макро- и микроэлементы, аминокислоты, витамины (табл.4).
| Таблица 4 | ||||||
| Химический состав культуральной жидкости (КЖ), автолизата мицелия (AM) и биомассы (БМ) гриба | ||||||
| Показатели | КЖ | AM | БМ | |||
| 1 | 2 | 3 | 4 | |||
| Общий анализ (масс %) | ||||||
| Сухие вещества | 1,5 | 76,8 | 93,1 | |||
| Общий белок | 2,5 | 46,3 | 47,5 | |||
| Жиры | 0,02 | 4,8 | 7,1 | |||
| Углеводы | 13,0 | 18,7 | 22,0 | |||
| Макро- и микроэлементы (мг/г) | ||||||
| Калий | 13,35 | 45,0 | 19,35 | |||
| Натрий | 1,25 | 5,88 | 17,5 | |||
| Кальций | 1,935 | 12,5 | 29,95 | |||
| Магний | 1,225 | 1,75 | 2,95 | |||
| Железо | 0,005 | 0,922 | 0,65 | |||
| Медь | 0,003 | 0,028 | 0,015 | |||
| Цинк | 0,03 | 0,062 | 0,043 | |||
| Марганец | 0,012 | 0,043 | 0,244 | |||
| Азот | 10 | 23,6 | 34,9 | |||
| Фосфор | 23 | 11,8 | 17,45 | |||
| Никель | 0,001 | 0,006 | 0,01 | |||
| Кобальт | 0,001 | 0,002 | ||||
| Свинец | н/обн | н/обн | н/обн | |||
| Ртуть | н/обн | н/обн | н/обн | |||
| Мышьяк | н/обн | н/обн | н/обн | |||
| Аминокислоты (% АСВ) | ||||||
| Лизин | 0,18 | 1,98 | 2,8 | |||
| Гистидин | 0,26 | 1,05 | 1,57 | |||
| Аргинин | 0,27 | 2,01 | 2,2 | |||
| Аспарагиновая к-та | 0,41 | 3,17 | 3,25 | |||
| Треонин | 0,18 | 1,33 | 2,00 | |||
| Серин | 0,15 | 1,23 | 1,70 | |||
| Пролин | 0,36 | 1,15 | 1,59 | |||
| Глицин | 0,24 | 1,35 | 1,75 | |||
| Аланин | 0,25 | 1,94 | 3,00 | |||
| Цистин | 0,10 | 0,18 | 0,45 | |||
| Валин | 0,21 | 1,70 | 1,90 | |||
| Метионин | 0,08 | 0,42 | 0,80 | |||
| Изолейцин | 0,16 | 1,25 | 1,37 | |||
| 1 | 2 | 3 | 4 |
| Лейцин | 0,18 | 2,10 | 2,25 |
| Тирозин | 0,01 | 1,1 | 1,40 |
| Фенилаланин | 0,11 | 1,25 | 1,81 |
| Глютаминовая к-та | 0,72 | 3,67 | 4,60 |
| Сумма аминокислот | 3,87 | 26,89 | 34,44 |
| Витамины (мг/г) | |||
| Bi (тиамина хлорид) | 0,001 | 0,009 | 11,2 |
| В2 (рибофлавин) | 0,088 | 0,11 | 60,0 |
| Вз (пантотеновая к-та) | 0,06 | 0,145 | 305,0 |
| В4(холин) | н/обн | н/обн | следы |
| В5 (никотиновая к-та) | 0,087 | 9,60 | 49,5 |
| В6 (пиридоксин) | 0,008 | 0,05 | 15,0 |
| В9(фолиевая к-та) | 0,017 | 0,025 | 12,5 |
| В12(цианокобаламин) | 0,0002 | 0,020 | 7,5 |
| Н(биотин) | следы | 0,001 | 1,5 |
| А (ретинол) | н/обн | н/обн | н/обн |
| Е (токоферол) | 0,031 | 0,032 | 0,1 |
Результаты исследования состава КЖ, AM и БМ показали, что автолизат мицелия и биомасса гриба более богаты по своему химическому составу, чем культуральная жидкость.
Белковые компоненты обоих продуктов (AM и БМ) содержат большой спектр аминокислот, в том числе и все незаменимые аминокислоты; в состав углеводов входит хитиновая клетчатка, адсорбирующая токсины и шлаки, а также биологически активные полисахариды (глюканы и галактоманнаны), регулирующие работу иммунной системы; в липидную фракцию входят такие физиологически активные вещества, как фосфолипиды, стерины, жирные кислоты (более 50% из них приходится на долю эссенциальных - линолевой и линоленовой, которые не синтезируются в организме человека и животных и должны поступать туда с пищей).
Следует отметить присутствие органических кислот (оксалиновой, яблочной, лимонной и др.), полного набора микро- и макроэлементов в легкоусвояемой форме (в виде органических соединений и их комплексов), а также комплекса витаминов, в том числе - группы В, которые играют важную роль в процессах белкового, липидного и углеводного обменов, а их недостаток вызывает нарушение функций нервной системы, кожи, слизистых оболочек кишечника, сосудистой системы и органов кровообращения.
Таким образом, биомасса и автолизат мицелия гриба являются по составу весьма ценным продуктом и обладают как высокой питательной ценностью, так и возможностью благотворного физиологического действия на организм животного.
Качество полученных на основе гриба препаратов характеризуют по показателям, приведенным в табл. 5, 6.
| Таблица 5 | |
| Основные показатели качества пребиотика | |
| Показатель | Значение |
| Концентрация водородных ионов (рН) | 6,6-7,0 |
| Массовая доля сухих веществ, %, не менее | 5,8 |
| Контаминация бактериальной и грибковой микрофлорой | Не допускается |
| Безвредность | Введение белым мышам препарата в тест-дозе 0,25 мл внутрь не должно вызывать изменений общего состояния животных в течение 10 дней |
| Таблица 6 | |
| Основные показатели качества биологически активной добавки | |
| Наименование показателя | Характеристика и нормы |
| 1 | 2 |
| Массовая доля сырого протеина в пересчете на АСВ, %, не менее | 38 |
| Массовая доля белка по Барнштейну в пересчете на АСВ, %, не менее | 28 |
| Массовая доля липидов в пересчете на АСВ, %, не более | 10 |
| Массовая доля углеводов в пересчете на АСВ, %, не более | 28 |
| Массовая доля золы в пересчете на АСВ, %, не более | 12 |
| Контаминация посторонней бактериальной и грибковой микрофлорой | Не допускается |
| Токсичность | Не допускается |
| Безвредность | Однократное скармливание дозы 3% от суточной нормы корма не должно вызывать изменений общего состояния животных в течение 10 дней |
Указанный технический результат данного изобретения обеспечивается также способами применения синбиотического комплекса молодняку крупного рогатого скота, свиней и птице в виде кормовых композиций, действие которых базируется на усилении полезных свойств препаратов при их совместном применении.
Первый способ связан с применением жидких препаратов пробиотика и пребиотика выпаиванием при их смешивании с питьевой водой и/или другими жидкостями (примеры 3, 4, 5). Синбиотический комплекс применяют для профилактики заболеваний ЖКТ:
- цыплятам-бройлерам и курам-несушкам препараты задают в дозе по 0,1 см3 каждого препарата на голову с питьевой водой, начиная с суточного возраста, ежедневно, двумя циклами с 1 по 7 и с 21 по 28 дни выращивания (пример 3);
- телятам препараты задают в первый, третий дни жизни и в день отъема по 10,0 см3 каждого препарата на голову с молоком или молозивом, один раз в день (пример 4);
- поросятам препараты задают в первый и третий дни жизни по 1,0 см3, в день отъема - по 1,5 см3 каждого препарата на голову с питьевой водой (пример 5).
Второй способ связан с применением жидкого пробиотического препарата одновременно с сухой биологически активной добавкой и включает выпаивание пробиотика и введение сухой добавки при смешивании ее с кормом (примеры 6, 7, 8). Синбиотический комплекс применяют для повышения физиологического статуса животных при стрессовых ситуациях (вакцинация, переход на другой вид корма и др.):
- цыплятам-бройлерам препараты задают, начиная с суточного возраста ежедневно в с 1 по 7 и с 21 по 28 дни выращивания, в следующих дозах - пробиотик по 0,1 см3 на голову в сутки с питьевой водой, биологически активная добавка - 1,5% (по массе) от суточного рациона корма (пример 6);
- телятам месячного возраста препараты задают, смешивая пробиотик с молоком в дозах - по 5,0 см3 на голову и биологически активную добавку с комбикормом - 1,5% (по массе) от суточного количества комбикорма в течение трех дней (пример 7);
- поросятам-отъемышам препараты задают, смешивая пробиотик по 1,5 см3 пробиотика на голову с питьевой водой и биологически активную добавку с комбикормом - 1,5% (по массе) от суточного количества комбикорма в течение пяти дней (пример 8).
Изобретение поясняется следующими примерами.
Пример 1. Получение бесклеточного пробиотика
Штаммы микроорганизмов, используемые для получения препарата, депонированы во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИГенетика: лактобактерии Lactobacillus plantarum штамм 8 РАЗ (ВКПМ №В-11007) и бактерии Bacillus subtilis штамм М-8 (ВКПМ №В-1948). В дополнение к паспортным данным их характеризовали по величине антагонистической активности (АнтА).
При определении АнтА в опытах in vitro установлен выраженный антагонизм штамма лактобактерии в отношении патогенных микроорганизмов (табл.7).
| Таблица 7 | ||
| Результаты определения антагонистической активности штамма лактобактерии, (n=10) | ||
| Патогенные микроорганизмы | зона задержки роста, мм | |
| экспериментальные данные | среднее | |
| S. typhimurium | 10; 11; 12; 10; 11; 10; 12; 11; 10; 12 | 10,9 |
| S. dublin | 12; 11; 10; 11; 10; 10; 12; 11; 11; 12 | 11,0 |
| S. gallinarum | 11; 12; 10; 10; 11; 12; 11; 10; 12; 11 | 11,0 |
| E.coli: K-88 | 15; 14; 13; 15; 14; 15; 13; 14; 13;14 | 14,0 |
| E.coli: K-99 | 16; 15; 14; 15; 15; 16; 14; 15; 16; 16 | 15,2 |
| E.coli: A-20 | 15; 14; 16; 15; 16; 16; 16; 15; 16; 15 | 15,4 |
При исследовании антагонистической активности штамма Bacillus subtilis, штамм М-8 (ВКПМ №В-1948), in vitro (п=10) установлено, что штамм обладает выраженным антагонизмом в отношении патогенных микроорганизмов, превышающим по величине аналогичные значения для лактобактерии (табл.8).
| Таблица 8 | ||
| Результаты определения антагонистической активности штамма Bacillus subtilis штамм М-8, (n=10) | ||
| Патогенные микроорганизмы | Зона задержки роста, мм | |
| Экспериментальные данные | среднее | |
| S. typhimurium | 21; 24; 21;24; 25; 22; 23; 25; 24; 22 | 23,1 |
| S. dublin | 19; 18; 19; 17; 19; 18; 19; 20; 17; 19 | 18,5 |
| S. gallinarum | 21; 24; 25; 25; 23; 24; 22; 24; 25; 21 | 23,4 |
| E.coli: K-88 | 18; 19; 20; 19; 18; 21; 22; 19; 18; 20 | 19,4 |
| E.coli: K-99 | 18; 20; 19; 18; 17; 19; 20; 18; 17; 20 | 18,6 |
| E.coli: A-20 | 16; 14;15; 16; 14; 16; 17; 17; 16; 17 | 15,8 |
Получение препаратов включает три этапа: раздельное культивирование бактерий, отделение культуральной жидкости от бактериальной массы, смешивание культуральных жидкостей.
Культивирование Lactobacillus plantarum штамм 8 РАЗ (ВКПМ №В-11007).
Посевной материал для культивирования бактерий в биореакторе получали выращиванием культуры в термостате в колбах. Культивирование бактерий в колбах и биореакторе проводили с питательной средой на основе молочной сыворотки (МС).
Состав среды МС: сухая молочная сыворотка - 30 г; (NH4)2SO4 - 5,0 г; КН2РО4 - 3,0 г; дрожжевой автолизат - 0,01 дм3; вода водопроводная - 1,0 дм3.
Характеристика среды после стерилизации (0,5 атм 30 мин): редуцирующих веществ (РВ) - 1,6%; NH4 - 0,9 г/дм3; Р2O5 - 0,5 г/дм3. Режимы культивирования приведены в табл.9.
| Таблица 9 | ||
| Режимы культивирования L. plantarum в колбах и биореакторе | ||
| Параметры культивирования | Колбы (V=1 дм3) | Реактор (V=30 дм3) |
| 1 | 2 | 3 |
| Посевная доза, % от объема питательной среды | 10 | 10 |
| Температура, °С | 31 | 31 |
| Время, ч | 71 | 23 |
| Перемешивание | каждые 12 ч | в течение первых двух часов (по 15 мин/ч, g=180 об/мин) |
| рН | начальное значение рН - 7,0-7,2 | начальное значение рН - 7,0-7,2; при культивировании поддерживали рН на уровне 6,5-7,0 (6%-ной аммиачной водой) |
| 1 | 2 | 3 |
| Конечная концентрация сахаров в среде, % | не определялась | 0,2 |
| Конечная концентрация сухих веществ в биомассе, г/дм | не определялась | 11 |
| Накопление бактерий, КОЕ/см3 | 5×109 | 3,5×109 |
Культивирование В. subtilis, штамм М-8 (ВКПМ №В-1948). Посевной материал для культивирования бактерий в биореакторе получали выращиванием культуры на качалке в колбах. Культивирование бактерий в колбах и биореакторе проводили с питательной средой на основе молочной сыворотки (МС).
Режимы культивирования приведены в табл.10.
| Таблица 10 | ||
| Режимы культивирования В. subtilis в колбах и биореакторе | ||
| Параметры культивирования | Колбы (V=1 дм3) | Реактор (V=30 дм3) |
| Посевная доза, % от объема питательной среды | 5 | 5 |
| Температура, °С | 37 | 37 |
| Время, ч | 44 | 42 |
| Перемешивание | на качалке (200 об/мин) | мешалкой (300 об/мин) |
| Аэрация | не проводилась | 1 дм3 воздуха/1 дм3 среды/мин |
| рН | начальное значение рН - 7,0-7,2 | начальное значение рН 7,0-7,2, в процессе культивирования величина рН не регулировалась |
| Конечная концентрация сухих веществ в биомассе, г/дм3 | не определялась | 15 |
| Накопление бактерий, КОЕ/см3 | 1,5×1010 | 6,5×1010 |
Получение готовой формы препарата. По окончании процесса культивирования клетки микроорганизмов удаляют из культуральных сред путем двухстадийной фильтрации на пористом многослойном керамическом фильтре для осветления и фильтровальной установке типа «Миллипор» с мембраной с размером пор 0,2 мкм для стерилизации препарата. Затем в асептических условиях культуральные жидкости (КЖ) бактерий L. plantarum и В. subtilis смешивают в объемном соотношении 1:1 и расфасовывают в стеклянные или полиэтиленовые флаконы.
Пример 2. Получение пребиотика (жидкого автолизата мицелия гриба F. sambucinum, шт.MKF 2001-3)
Для разработки пребиотика и биологически активной добавки в качестве продуцента БАВ использован штамм гриба Fusarium sambucinum MKF-2001-3 (патент РФ №2259209 «Штамм гриба Fusarium sambucinum -продуцент биологически активных веществ», опубликовано: 27.08.2005 Бюл. №24). Штамм депонирован в ВКПМ (№F - 867).
Пребиотик представляет собой стерильный автолизат мицелия гриба (AM), полученной при культивировании Fusarium sambucinum MKF-2001-3 в питательной среде на основе молочной сыворотки, с последующим водным автолизом биомассы, отделением автолизата центрифугированием и стерилизации фильтрата ультрафильтрацией на полых волокнах.
Культивирование гриба F. sambuci
Медаль Альфреда Нобеля