Мозаичный рекомбинантный полипептид, содержащий фрагменты белков вируса гепатита Е 1 и 3 генотипов в одной полипептидной цепи, предназначенный для использования в тест-системах, применяемых в серодиагностике гепатита Е

Название	Мозаичный рекомбинантный полипептид, содержащий фрагменты белков вируса гепатита Е 1 и 3 генотипов в одной полипептидной цепи, предназначенный для использования в тест-системах, применяемых в серодиагностике гепатита Е
Разработчик (Авторы)	Г.И.Алаторцева, А.В. Сидоров,Л.Н. Нестеренко, Л.Н. Лухверчик, И.И.Амиантова, В.В. Доценко, Д.С. Воробьев, А.В. Милованова, М.И. Михайлов, К.К. Кюрегян, З.Ш.Нурматов, О.Т. Касымов, С.В.Жаворонок, П.А. Красочко, В.В.Зверев
Вид объекта патентного права	Изобретение
Регистрационный номер	2754791
Дата регистрации	07.09.2021
Правообладатель	Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова»
Область применения (класс МПК)	G01N 33/53 (2006.01) C07K 14/00 (2006.01)

Описание изобретения

Изобретение относится к биотехнологии и иммунологии и представляет собой генно-инженерную конструкцию белка, кодирующую мозаичный полипептид с фрагментами белков ORF2 и ORF3 ВГЕ 1 и 3 генотипов в одной рамке считывания, который может найти применение в тест-системах для серодиагностики гепатита Е.

Гепатит Е (ГЕ) представляет значимую проблему для здравоохранения, и неоспоримо важным является совершенствование его лабораторной диагностики. Основным лабораторным показателем инфицирования вирусом гепатита Е (ВГЕ) является выявление в сыворотке крови больных специфических антител методом иммуноферментного анализа (ИФА). Из-за трудностей, связанных с культивированием ВГЕ известные к настоящему времени диагностические тест-системы основаны главным образом на использовании рекомбинантных антигенов.

Описано 8 генотипов вируса, из них вирусы 1-4 генотипов вызывают заболевание у людей. На гиперэндемичных территориях циркулируют ВГЕ 1 и 2 генотипов, вызываемая ими инфекция является строгим антропонозом. К таким территориям относятся страны Африки, Америки, Азии. ВГЕ 3 и 4 генотипов, доминирующие на эндемичных и неэндемичных территориях, инфицирующий не только человека, но животных (домашних и диких свиней, диких кабанов, оленей, кроликов). Доказана зоонозная передача ВГЕ 3 и 4 генотипов. ВГЕ 3 генотипа отвечает за спорадические случаи во всем мире, включая Европу и США, ВГЕ 4 генотипа преобладает в Юго-Восточной Азии. Заболевание, вызываемое ВГЕ 1 генотипа, является строгим антропонозом и распространено на территории стран постсоветского пространства Центральной Азии. В данной работе была поставлена задача получения мозаичного рекомбинантного мозаичного рекомбинантного полипептида, содержащего аминокислотные последовательности ВГЕ 1 и 3 генотипов штамма, циркулирующих в странах СНГ и имеющих эпидемиологическую значимость с точки зрения возможного завоза в Россию в связи с усилением международной трудовой миграции.

Первоначально диагностика гепатита E основывалась на серологическом исключении вирусных гепатитов другой этиологии. Большинство разработанных к настоящему времени методов серодиагностики гепатита E основано на определении антител к белкам-продуктам второй и третьей открытых рамок считывания генома вируса гепатита E в сыворотках крови. Для этих целей используются различные подходы, в которых применяется принцип иммуноферментного анализа (ИФА), метода иммунофлюоресценции, иммуноблотинга. Применение этой группы методов базируется на использовании синтетических пептидов-фрагментов вирусных белков или рекомбинантных полипептидов, содержащих фрагменты вирусных антигенов. Одним из наиболее перспективных путей совершенствования диагностических тест-систем является применение в качестве антителосвязывающего субстрата рекомбинантных белков вируса гепатита E, синтезированных в различных экспрессирующих системах. Такие рекомбинантные белки, сохраняющие антигенные детерминанты вируса гепатит E, используются в серодиагностике заболевания, обеспечивая высокие показатели чувствительности и специфичности используемых тестов (патент US 5563032, кл. 435/5, 08.10.96).

Геном ВГЕ представляет собой одноцепочечную полиаденилированную РНК положительной полярности размером 7,3 тысяч нуклеотидных остатков (т.н.о.), содержит три открытых рамки считывания orf1, orf2 и orf3, а также недавно обнаруженную четвертую открытую рамку считывания orf4, трансляция которой происходит через внутренний сайт связывания рибосом. В процессе жизненного цикла вируса синтезируется субгеномная бицистронная РНК размером 2,2 т.н.о., кодирующая основные антигенно значимые белки ORF2 и ORF3 Ген orf2 ВГЕ кодирует капсидный белок протяженностью 660 аминокислотных остатков (а.о.) с молекулярной массой 72kDa. Известно, что для ВГЕ нейтрализующие антигенные детерминанты располагаются в области двух третей С-концевого участка ORF2-белка. Тест-системы, в которых используются различные по аминокислотным последовательностям рекомбинантные антигены ORF2 ВГЕ, различаются по показателям диагностической эффективности. Так тесты, в которых применяются антигены, включающие участок рЕ2 (394-606 а.о.) белка ORF2 (Wantai, Китай), в 10 раз превосходят по чувствительности диагностикумы, в которых данный фрагмент белка не используется (GenLabs, Сингапур). Применение антигена ORF2 позволяет изучать сероконверсию на более поздних сроках реконвалесценции и обнаруживать анамнестические антитела. Другим диагностически значимым антигеном является продукт гена orf3 - белок ORF3, или VP13, с молекулярной массой 13 kDa и протяженностью 113-114 а.о. ORF3 - мультифункциональный регуляторный белок, отвечающий за уклонение вируса от иммунного ответа хозяина, регуляцию репликации вируса, сборку и созревание вирионов, выход вируса из инфицированной клетки. Установлено, что в составе белка ORF3 имеется 3 антигенных домена в области 31 – 40 а.о., 63 - 76 а.о. и С-концевого участка, который содержит основные иммунодоминантные эпитопы. Известно, что обогащенный пролином мотив «PXXP» (в положении 63-76 а.о.) содержит линейные и поверхностно-ориентированные генотип-специфические антигенные сайты. Диагностически важной особенностью белка ORF3 является его способность взаимодействовать с сыворотками крови больных на поздних сроках острой фазы инфекции и в ранней фазе реконвалесценции. Применение антигенов, в полной мере содержащих иммунодоминантные участки данного белка перспективно не только с точки зрения возможности выявления генотип-специфических антител, но и для определения давности инфицирования и стадии заболевания гепатитом Е (ГЕ).

Наиболее близким аналогом является решение по патенту RU №2172346, опубл. 20.08.2001. В нем описан способ получения полипептида, обладающего антигенной активностью ВГЕ, предусматривающий создание участка ДНК, кодирующего полипептид, клонирование в векторной системе экспрессии с получением рекомбинантной ДНК, трансформацию клеток штамма-хозяина полученной рекомбинантной плазмидной ДНК, культивирование трансформантов и выделение целевого продукта. Особенностями способа получения полипептида заключается в получении фрагментов ДНК, кодирующих полипептиды, содержащих фрагмент белков - продуктов второй или третьей открытых рамок считывания генома ВГЕ. Создают участок ДНК, кодирующий полипептид, содержащий фрагмент белков - продуктов второй открытой рамки считывания вирусного генома с аминокислотной последовательностью (см. графическую часть формулы). Создают участок ДНК, кодирующий полипептид, содержащий фрагмент белков - продуктов второй открытой рамки считывания вирусного генома с аминокислотной последовательностью (см. графическую часть формулы). Создают участок ДНК, кодирующий полипептид, содержащий фрагмент белков-продуктов третьей открытой рамки считывания вирусного генома с аминокислотной последовательностью (см. графическую часть формулы).

Также в прототипе описан набор для определения антител к возбудителю гепатита Е-вирусу гепатита Е, включающий иммуносорбент, на основе антигенов вируса гепатита Е, реагенты для определения присутствия антител, отличающийся тем, что в качестве антигена вируса гепатита Е он содержит фрагменты белков - продуктов второй и/или третьей открытых рамок считывания вирусного генома, имеющие аминокислотные последовательности, охарактеризованные в пп.2-4 соответственно, иммобилизованные на твердом носителе в смеси и/или по отдельности.

Наиболее близким аналогом является решение по патенту RU2711907, опубликовано: 23.01.2020. В нем описан рекомбинантный белок, содержащий антигенно-значимый фрагмент белка вируса гепатита Е 1 генотипа, используемый в тест-системах для серодиагностики гепатита Е, где рекомбинантный белок имеет аминокислотную последовательность, где последовательность без учета белка-носителя (бета-галактозидазы), С-концевой фрагмент, почти полноразмерный белковый продукт ORF3 (жирный шрифт) - без одного Arg на С-конце (канонически Gln-Leu-Gly-Pro-Arg-Arg), последние 8 аминокислотных остатков на С-конце относятся к вектору, полноразмерный белковый продукт ORF3 (жирный шрифт), последние 9 аминокислотных остатков на С-конце относятся к вектору.

Технической проблемой прототипа является следующее.

ГЕ, вызываемый ВГЕ, является эмерджентным заболеванием с повсеместным распространением и в настоящее время признается важной глобальной проблемой общественного здравоохранения. В России и на территории стран постсоветского пространства доминируют штаммы ВГЕ 1 и 3 генотипов.

В связи с трудностью получения натуральных антигенов, в серодиагностике данного заболевания наибольшее распространение получили рекомбинантные антигены (РекАг), содержащие различные фрагменты белков ORF2 и ORF3 ВГЕ. В зависимости от используемых РекАг наборы для диагностики ГЕ широко различаются по чувствительности и специфичности. РекАг часто содержат в своем составе белки-носители (например, β-галактозидазу E.coli), способствующие повышению уровня экспрессии целевых продуктов и облегчению технологии их выделения.

Однако присутствие таких белков часто приводит к снижению локальной концентрации диагностически-значимых эпитопов при сорбции на твердой фазе, что может быть ослаблено за счет повышения относительного содержания вирусоспецифических последовательностей в составе химерного РекАг.

Для повышения специфичности РекАг ВГЕ в иммунохимических тестах, задачей настоящего изобретения является предложение получения гибридного белка, содержащего антигенно значимые эпитопы вирусных белков ORF2 и ORF3 ВГЕ 1 и 3 генотипов в составе одной полипептидной цепи, для чего необходимо сконструировать рекомбинантную плазмиду pEL5cSHE, содержащую фрагменты генов orf2 и orf3 ВГЕ 1 и 3 генотипов.

Техническими результатами изобретения являются: генно-инженерная конструкция, содержащая фрагменты генов orf2 и orf3 ВГЕ 1 и 3 генотипов в одной рамке считывания; штамм-продуцент мозаичного рекомбинантного полипептида с фрагментами белков ORF2 и ORF3 ВГЕ 1 и 3 генотипов в составе одной полипептидной цепи; очищенный мозаичный рекомбинантный полипептид с фрагментами белков ORF2 и ORF3 ВГЕ 1 и 3 генотипов в составе одной полипептидной цепи. Использованные подходы позволили масштабировать получение белка и упростить технологию его выделения и очистки.

Указанные задача и технический результат достигаются за счет того, что заявлен белок, кодирующий мозаичный полипептид с фрагментами белков ORF2 и ORF3 ВГЕ 1 и 3 генотипов, имеющий аминокислотную последовательность:

MetGlyArgGlySerAsnGlyGluProThrValLysLeuTyrThrSerValGluAsnAla

GlnGlnAspLysGlyIleAlaIleProHisAspIleAspLeuGlyAspSerArgValVal

IleGlnAspTyrAspAsnGlnHisGluGlnAspArgProThrProSerProAlaProSer

ArgProPheSerValLeuArgAlaAsnAspValLeuTrpLeuSerLeuThrAlaAlaGlu

TyrAspGlnThrThrTyrGlySerSerThrAsnProMetTyrValSerAspThrValThr

PheValAsnValAlaThrGlyAlaGlnAlaValAlaArgSerLeuAspTrpSerLysVal

ThrLeuAspGlyArgProLeuThrThrIleGlnGlnTyrSerLysThrPheTyrValLeu

ProLeuArgGlyLysLeuSerPheTrpGluAlaGlyThrThrLysAlaGlyTyrProTyr

AsnTyrAsnThrThrAlaSerAspGlnIleLeuIleGluAsnAlaAlaGlyHisArgVal

AlaIleSerThrTyrThrThrSerLeuGlyAlaGlyProValSerValSerAlaValGly

ValLeuAlaProHisSerAlaLeuAlaValLeuGluAspThrIleAspTyrProAlaArg

AlaHisThrPheAspAspPheCysProGluCysArgAsnLeuGlyLeuGlnGlyCysAla

PheGlnSerThrValAlaGluLeuGlnArgLeuLysMetLysValGlyLysThrArgGlu

SerGlySerGluPheAsnGlyGluProThrValLysLeuTyrThrSerValGluAsnAla

GlnGlnAspLysGlyIleAlaIleProHisAspIleAspLeuGlyGluSerArgValVal

IleGlnAspTyrAspAsnGlnHisGluGlnAspArgProThrProSerProAlaProSer

ArgProPheSerValLeuArgAlaAsnAspValLeuTrpLeuSerLeuThrAlaAlaGlu

TyrAspGlnSerThrTyrGlySerSerThrGlyProValTyrValSerAspSerValThr

LeuValAsnValAlaThrGlyAlaGlnAlaValAlaArgSerLeuAspTrpThrLysVal

ThrLeuAspGlyArgProLeuSerThrIleGlnGlnTyrSerLysThrPhePheValLeu

ProLeuArgGlyLysLeuSerPheTrpGluAlaGlyThrThrLysAlaGlyTyrProTyr

AsnTyrAsnThrThrAlaSerAspGlnLeuLeuValGluAsnAlaAlaGlyHisArgVal

AlaIleSerThrTyrThrThrSerLeuGlyAlaGlyProValSerIleSerAlaValAla

ValLeuAlaProHisSerAlaLeuAlaLeuLeuGluAspThrMetAspTyrProAlaArg

AlaHisThrPheAspAspPheCysProGluCysArgProLeuGlyLeuGlnGlyCysAla

PheGlnSerThrValAlaGluLeuGlnArgLeuLysMetLysValGlyLysThrArgGlu

LeuGluPheGluLeuMetGlySerProCysAlaLeuGlyLeuPheCysCysCysSerSer

CysPheCysLeuCysCysProArgHisArgProAlaSerArgLeuAlaAlaValValGly

GlyAlaAlaAlaValProAlaValValSerGlyValThrGlyLeuIleLeuSerProSer

ProSerProIlePheIleGlnProThrProLeuProProThrSerTyrHisAsnProGly

LeuGluLeuAlaLeuAspSerArgProAlaProSerAlaProLeuGlyValThrSerPro

SerAlaProProLeuProProValValAspLeuProGlnLeuGlyLeuArgArgIlePhe

IleGlnProThrProSerProProMetSerProLeuArgProGlyLeuAspLeuValPhe

AlaAsnProProAspHisSerAlaProLeuGlyValThrArgProSerAlaProProLeu

ProHisValValHisLeuProGlnLeuGlyProArgGluLeuArgArg

Жирным шрифтом выделены фрагменты белков ORF2 и ORF3 ВГЕ 1 и 3 генотипов.

Осуществление изобретения

«Гибридный» ген, собранный из 3´-концевых фрагментов генов orf2 ВГЕ 1 и 3 генотипов, последовательности гена orf3 3 генотипа и 3’-концевого участка гена orf3 1 генотипа, был клонирован в векторе pEL5a, модифицированном с целью уменьшения размера фрагмента β-галактозидазы с помощью делеции двух третей гена LacZ. Для повышения уровня экспрессии в клетках E.coli проведена оптимизация кодонов вирусоспецифических фрагментов ДНК.

Таким образом, получена генно-инженерная конструкция, кодирующая мозаичный полипептид с фрагментами белков ORF2 и ORF3 ВГЕ 1 и 3 генотипов в одной рамке считывания. Оптимизация кодонов клонированных фрагментов вирусоспецифической ДНК и сохранение на 5´-конце гибридного гена участка, кодирующего фрагмент белка-носителя (β-галактозидазы E.coli), позволили повысить уровень экспрессии разрабатываемого мозаичного РекАг и упростить процесс его выделения и очистки.

Получен белок, кодирующий мозаичный полипептид с фрагментами белков ORF2 и ORF3 ВГЕ 1 и 3 генотипов, имеющий аминокислотную последовательность:

MetGlyArgGlySerAsnGlyGluProThrValLysLeuTyrThrSerValGluAsnAla

GlnGlnAspLysGlyIleAlaIleProHisAspIleAspLeuGlyAspSerArgValVal

IleGlnAspTyrAspAsnGlnHisGluGlnAspArgProThrProSerProAlaProSer

ArgProPheSerValLeuArgAlaAsnAspValLeuTrpLeuSerLeuThrAlaAlaGlu

TyrAspGlnThrThrTyrGlySerSerThrAsnProMetTyrValSerAspThrValThr

PheValAsnValAlaThrGlyAlaGlnAlaValAlaArgSerLeuAspTrpSerLysVal

ThrLeuAspGlyArgProLeuThrThrIleGlnGlnTyrSerLysThrPheTyrValLeu

ProLeuArgGlyLysLeuSerPheTrpGluAlaGlyThrThrLysAlaGlyTyrProTyr

AsnTyrAsnThrThrAlaSerAspGlnIleLeuIleGluAsnAlaAlaGlyHisArgVal

AlaIleSerThrTyrThrThrSerLeuGlyAlaGlyProValSerValSerAlaValGly

ValLeuAlaProHisSerAlaLeuAlaValLeuGluAspThrIleAspTyrProAlaArg

AlaHisThrPheAspAspPheCysProGluCysArgAsnLeuGlyLeuGlnGlyCysAla

PheGlnSerThrValAlaGluLeuGlnArgLeuLysMetLysValGlyLysThrArgGlu

SerGlySerGluPheAsnGlyGluProThrValLysLeuTyrThrSerValGluAsnAla

GlnGlnAspLysGlyIleAlaIleProHisAspIleAspLeuGlyGluSerArgValVal

IleGlnAspTyrAspAsnGlnHisGluGlnAspArgProThrProSerProAlaProSer

ArgProPheSerValLeuArgAlaAsnAspValLeuTrpLeuSerLeuThrAlaAlaGlu

TyrAspGlnSerThrTyrGlySerSerThrGlyProValTyrValSerAspSerValThr

LeuValAsnValAlaThrGlyAlaGlnAlaValAlaArgSerLeuAspTrpThrLysVal

ThrLeuAspGlyArgProLeuSerThrIleGlnGlnTyrSerLysThrPhePheValLeu

ProLeuArgGlyLysLeuSerPheTrpGluAlaGlyThrThrLysAlaGlyTyrProTyr

AsnTyrAsnThrThrAlaSerAspGlnLeuLeuValGluAsnAlaAlaGlyHisArgVal

AlaIleSerThrTyrThrThrSerLeuGlyAlaGlyProValSerIleSerAlaValAla

ValLeuAlaProHisSerAlaLeuAlaLeuLeuGluAspThrMetAspTyrProAlaArg

AlaHisThrPheAspAspPheCysProGluCysArgProLeuGlyLeuGlnGlyCysAla

PheGlnSerThrValAlaGluLeuGlnArgLeuLysMetLysValGlyLysThrArgGlu

LeuGluPheGluLeuMetGlySerProCysAlaLeuGlyLeuPheCysCysCysSerSer

CysPheCysLeuCysCysProArgHisArgProAlaSerArgLeuAlaAlaValValGly

GlyAlaAlaAlaValProAlaValValSerGlyValThrGlyLeuIleLeuSerProSer

ProSerProIlePheIleGlnProThrProLeuProProThrSerTyrHisAsnProGly

LeuGluLeuAlaLeuAspSerArgProAlaProSerAlaProLeuGlyValThrSerPro

SerAlaProProLeuProProValValAspLeuProGlnLeuGlyLeuArgArgIlePhe

IleGlnProThrProSerProProMetSerProLeuArgProGlyLeuAspLeuValPhe

AlaAsnProProAspHisSerAlaProLeuGlyValThrArgProSerAlaProProLeu

ProHisValValHisLeuProGlnLeuGlyProArgGluLeuArgArg

Жирным шрифтом выделены фрагменты белков ORF2 и ORF3 ВГЕ 1 и 3 генотипов.

Получение заявленного изобретением белка осуществлялось следующими этапами.

На первом этапе получили штамм E.coli - продуцент мозаичного рекомбинантного полипептида, содержащего аминокислотные последовательности белков ORF2 и ORF3 ВГЕ 1 и 3 генотипов.

На территории СНГ разнообразие циркулирующих штаммов ВГЕ ограничивается, в основном, первым и третьим генотипами. Для улучшения диагностических свойств тест-систем, запланированных в проекте к разработке, была поставлена задача собрать антигенно значимые эпитопы вирусных белков ORF2 и ORF3 ВГЕ 1 и 3 генотипов в одну мозаичную структуру. Для получения системы, экпрессирующей такой гибридный белок, были использованы ранее полученные ркомбинантные плазмиды, содержащие фрагменты генов ВГЕ 1 и 3 генотипов (см.:

[1. Алаторцева, Г.И. Получение рекомбинантного белка ORF3 вируса гепатита Е 1-го генотипа с применением метода оптимизации кодонов. / Алаторцева Г.И. Сидоров А.В., Нестеренко Л.Н., Лухверчик Л.Н., Доценко В.В., Амиантова И.И., Кабаргина В.Ю., Милованова А.В., Воробьев Д.С., Аммур Ю.И., Блинов В.М., Нурматов А.З., Нурматов3.Ш., Байызбекова Д.А., Касымов О.Т., Кюрегян К.К., Михайлов М.И., Жаворонок С.В., Зверев В.В. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии – 2017 – N 6 – C. 63-72.

2. Алаторцева, Г.И. Получение рекомбинантного аналога капсидного белка вируса гепатита Е первого генотипа: клонирование, экспрессия, очистка, оценка антигенных свойств. / Г.И. Алаторцева, А.В. Сидоров, Л.Н. Нестеренко, Л.Н. Лухверчик, В.В. Доценко, И.И. Амиантова, А.В. Милованова, Д.С. Воробьев, Ю.И. Аммур, М.И. Михайлов, К.К. Кюрегян, В.С. Кичатова, И.А. Потемкин, О.В. Исаева, Е.Ю. Малинникова, А.А. Карлсен, В.М. Блинов, З.Ш. Нурматов, А.З. Нурматов, О.Т. Касымов, С.В. Жаворонок, В.В. Зверев // ЖМЭИ – 2017 – N 6 – C. 72-80.

3. Алаторцева, Г.И. Получение рекомбинантного белка ORF3 вируса гепатита Е 3 генотипа и оценка его антигенных свойств. / Алаторцева Г.И., Сидоров А.В., Нестеренко Л.Н., Лухверчик Л.Н., Милованова А.В., Аммур Ю.И., Михайлов М.И., Кюрегян К.К., Жаворонок С.В., Зверев В.В. // ЖМЭИ – 2018 – N. 5 – C. 46-53.

4. Алаторцева, Г.И. Разработка рекомбинантного белка капсида вируса гепатита Е третьего генотипа: клонирование, экспрессия, очистка, оценка антигенных свойств. / Алаторцева Г.И., А.В. Сидоров, Л.Н. Нестеренко, Л.Н. Лухверчик, В.В. Доценко, И.И. Амиантова, М.В. Жукина, В.Ю. Кабаргина, А.В. Милованова, Д.С. Воробьев, Ю.И. Аммур, М.И. Михайлов, К.К. Кюрегян, Е.Ю. Малинникова, С.В. Жаворонок, В.М. Блинов, В.В. Зверев // ЖМЭИ – 2019 – N. 1 – С. 10-17.

4. Изобретение RU2711907 (прототип)].

Ниже представлены результаты по получению экспрессирующего вектора и штамма E.coli - продуцента мозаичного рекомбинантного полипептида, содержащего аминокислотные последовательности белков ORF2 и ORF3 ВГЕ 1 и 3 генотипов.

Использовали бактериальные штаммы и плазмидные векторы: штаммы E.coli PLT90: (F- lon: Tn10 (TetR) endA1 malPpa: [PR, c1857] Mal-, λ imm) thi hsdR17) [см. RU2043409]. Векторы pAL2-T и pKAN-T(Евроген) применяли для клонирования продуктов ПЦР; pET28a (Novagen, Merck Biosciences, США) – для сборки мозаичного фрагмента; pEL5c, производную вектора pEL5a [см. RU №2071503, опубл. 10.01.1997] – для экспрессии рекомбинантного полипептида. В работе использовали компетентные клетки E.сoli CC001 (Евроген) генотипа XL-Blue; для экспрессии – штамм E.сoli PLT90.

В качестве сырья и реактивов использовали нижеследующие:

Дрожжевой экстракт, пептон, глицерин, глюкоза безводная, пеногаситель, магния сульфат, кальция хлорид, калия дигидрофосфат, тетрациклин, ампициллин, калия гидрофосфат, натрия гидроксид, натрия хлорид, вода, очищенная на приборе «Simplicity UV» (Merck Millipore, Франция) до конечного удельного сопротивления 18 мегаОм/см. Cмеси нуклеотидтрифосфатов, буферные растворы для проведения работ по клонированию, синтезу и очистке праймеров заказывали в компаниях ЗАО «Синтол» и ООО «Евроген», Россия. Набор для идентификации грамотрицательных палочек «api 20 E» (компания «bioMérieux», Франция). Среды готовили, используя триптон и NaCl (Panreac, Испания), дрожжевой экстракт (Becton Dickinson, США), бакто-агар (Difco, США). В работе использовали реактивы и ферменты следующих производителей: эндонуклеазы рестрикции производства компаний ThermoFiisher (США), СибЭнзим (Россия); соли и другие химические реактивы – Хеликон (Россия), Sigma (США), Merck (США), Панэко (Россия); антарктическую щелочную фосфатазу – ThermoFisher (США); T4 ДНК лигазу – Евроген (Россия); термофильную Taq ДНК Полимеразу – Синтол (Россия); высокоточную Phusion ДНК Полимеразу – ThermoFisher (США).

- пероксидазный конъюгат мышиных моноклональных антител к IgG человека ООО «Сорбент-Сервис» (Россия);

- мышиные моноклональные (МАТ) к иммуноглобулинам класса G человека;

- антивидовой конъюгат «Пероксидаза - антитела козы к иммуноглобулинам кролика», кат. № P-GAR Iss, (ООО «Имтек», Россия);

- рекомбинантные полипептиды ORF2/3_ВГЕ1/3, ORF2 ВГЕ 1 и 3 генотипов, ORF3 ВГЕ 3 генотипа из коллекции рекомбинантных антигенов ФГБНУ «НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» (ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова);

- поликлональные кроличьи антитела α1.9.11.15, полученные к рекомбинантному белку ORF2 1 генотипа, от 06.11.15;

- поликлональные кроличьи антитела α1.63.06.18, полученные к рекомбинантному белку ORF2 3 генотипа, от 05.06.18;

- поликлональные кроличьи антитела α1.84.01.18, полученные к рекомбинантному белку ORF3 3 генотипа, от 15.01.18;

- поликлональные кроличьи антитела α1.54.11.19, полученные к рекомбинантному полипептиду ORF2/3-ВГЕ1/3, от 18.11.19

- поликлональные кроличьи антитела β1.46.04.19, полученные к рекомбинантному антигену р120 ВИЧ-1, от 25.04.19.

Все препараты поликлональных кроличьих антител в предварительных исследованиях показали отсутствие взаимодействия с β-галактозидазой E.coli.

Образцы сывороток крови, отрицательные (n=30) и положительные (n=30) в отношении содержания IgG-антител и IgМ-антител к ВГЕ, предоставленные БГМУ (Минск, Беларусь) и НПО «Профилактическая медицина» (Бишкек, Кыргызстан). Все образцы были протестированы: на содержание IgG-антител к ВГЕ с помощью наборов реагентов «ДС-ИФА-АНТИ-HEV-G», экспериментального образца тест-системы для определения суммарных антител к ВГЕ «Скрин-ВГЕ-АТ» (НИИВС им. И. И. Мечникова) и «RecomWeel HEV IgG» (Euroimmun, Германия).

Наборы мебран mdi Easypack «Advanced Microdevices» (Индия), включающие закрепленную на твердой основе рабочую мембрану CNPF SN12 с размером пор 10 мкм, стекловолоконную мембрану для коллоидного конъюгата PT R7, мембрану для нанесения пробы FR 1 и конечную адсорбирующую мембрану AP045.

Использовали следующие методы.

Биоинформационные методы. Стратегию клонирования, включая анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей и дизайн праймеров, а также оптимизацию кодонов разрабатывали, используя пакет программ Vector NTI ver. 11.0. Сравнительный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей проводили с помощью программы AlignX, входящей в пакет Vector NTI. Оптимизацию кодонов проводили по частоте встречаемости кодонов в белке-носителе вектора для экспрессии с последующим заказом синтеза оптимизированной последовательности в фирме Евроген (Россия).

Молекулярно-биологические методы. Для приготовления стандартных микробиологических сред и буферных растворов использовали общепринятые протоколы [Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. – М.: Мир, 1984. – 487 c]. Синтез праймеров для проведения ПЦР и секвенирования проводили на автоматическом ДНК синтезаторе ASM-1000 фирмы «Биосет», Новосибирск, Россия в ЦКП ВНИИСБ «Биотехнология». Определение нуклеотидной последовательности ДНК проводили методом Сэнгера в модификации капиллярного электрофореза в ЦКП ВНИИСБ «Биотехнология» на геномном анализаторе ABI-3130-XL фирмы «Applied Biosystems», США.

Электрофорез ДНК в агарозном геле. Разделение фрагментов ДНК в агарозном геле проводили стандартным методом [Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. – М.: Мир, 1984. – 487 c]. Фрагменты ДНК визуализировали с помощью интеркалирующего красителя бромистого этидия, добавляемого в гель. Концентрацию агарозы в геле подбирали в зависимости от молекулярной массы разделяемых фрагментов ДНК, варьируя от 0,7 до 2 %. В качестве маркеров молекулярных масс использовали ДНК бактериофага λ, обработанную рестриктазой Pst1.

Определение концентрации ДНК. Концентрацию ДНК (двуцепочечной ДНК в плазмидах и ДНК-фрагментах, либо одноцепочечной ДНК в олигонуклеотидах) оценивали по соотношениям значений оптической плотности при длинах волн 230 нм, 260 нм и 280 нм, определенных на спектрофотометре NanoDrop 2000 (ThermoFisher, США). Альтернативно концентрацию двуцепочечной ДНК определяли, сравнивая интенсивность полос образцов и маркеров молекулярных масс на электрофореграммах агарозных гелей на приборе Molecular Imager GelDoc (Bio-Rad).

Выделение плазмидной ДНК мультикопийных плазмид. Плазмидную ДНК выделяли из 5 мл ночной культуры бактерий на колонках фирмы Евроген по протоколу производителя.

Выделение плазмидной ДНК малокопийных плазмид. Для выделения малокопийной плазмидной ДНК при культивировании бактериальных культур использовали среду TB, отличающуюся повышенным содержанием дрожжевого экстракта (24 г/л) [Wood, W.N. Enhancing Yields of Low and Single Copy Number Plasmid DNAs From Escherichia Coli Cells / Wood W.N., Smith K.D., Ream J.A., Lewis L.K. // J Microbiol Meth – 2017 – Vol. 133 – P. 46-51.].

Выделение ДНК из агарозного геля. Фрагмент ДНК (продукты ПЦР или фрагменты ДНК) разделяли с помощью электрофореза в агарозном геле в присутствии красителя кристаллического фиолетового в концентрации 100 мкг/мл. Минимально необходимое исходное количество ДНК для разделения, составляющее 2-3 мг, определяли спектрофотометрически или по результатам предварительного электрофореза в присутствии бромистого этидия. После разделения из геля на свету вырезали полоску синего цвета нужной молекулярной массы и очищали на колонках фирмы «Евроген» (Россия) согласно протоколу производителя.

Очистка ДНК после ферментативных реакций. ДНК после ферментативных реакций очищали на колонках производства фирмы «Евроген» (Россия) согласно рекомендациям производителя.

Амплификация ДНК. Амплификацию фрагментов ДНК проводили с помощью высокоточной ДНК-полимеразы Phusion (Thermofisher, США) согласно рекомендациям производителя. Продукты ПЦР обрабатывали дополнительно Taq полимеразой (Синтол, Россия) для возможности проведения последующего А/Т-клонирования.

Приготовление вектора. Для A/T клонирования продуктов ПЦР использовали коммерческие наборы фирмы Евроген (Россия). При клонировании по сайтам рестрикции плазмидную ДНК после расщепления соответствующей рестриктазой дополнительно обрабатывали щелочной фосфатазой (Shrimp Alkaline Phospatase, ThermoFisher, США) с последующей очисткой на колонках Евроген (Россия).

Лигирование. Лигирование полученной проводили при +10 ºС в течение 12 часов с молярным соотношением концентраций лигируемых концов вектор:вставка в пределах 1:3 - 1:15.

Трансформация. Трансформацию компетентных клеток E.coli СС001 (Евроген, Россия), либо E.coli PLT90 проводили по следующему протоколу: к 100 мкл компетентных клеток добавляли 3 мкл лигазной смеси и выдерживали во льду в течение 30 минут. Затем компетентные клетки нагревали (тепловой шок) в водяной бане при температуре от +32°С до +34°С (E.coli PLT90) или от +4°С до +42°С (E.coli СС001) в течение 30-45 сек. Далее снова выдерживали во льду в течение 5 минут и добавляли среду SOC [Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. – М.: Мир, 1984. – 487 c.] из расчета на 100 мкл клеток - 200 мкл среды. Полученную смесь выдерживали в суховоздушном шейкере-инкубаторе при 220 об/мин в течение 1 часа при температуре +30°С (E.coli PLT90) или +37°С (E.coli СС001). Затем высевали по 50 мкл смеси на LB-агар с нужным антибиотиком (ампицилин или канамицин) и выращивали при температуре +30°С (E.coli PLT90) или +37°С (E.coli СС001) в течение 16-20 часов. На следующий день отбирали отдельные колонии и засевали в 5 мл жидкой среды с антибиотиком. Инкубацию проводили при 220 об/мин в течение 18-24 часов при температуре +30°С (E.coli PLT90) или +37°С (E.coli СС001). Выросшую культуру центрифугировали при 5000 об/мин в течение 20 мин при +4°С. Надосадочную жидкость сливали, осадок бактерий использовали для выделения плазмидной ДНК.

Электрофорез белков в полиакриламидном геле проводили по методу Лэммли (https://doi.org/10.21769/BioProtoc.80). Электрофорез проводили на приборе приборе Mini-ProteanTetraCellSystem фирмы «BioRad» (США) в 7,5 % или 10 % разделяющем SDS - полиакриламидном геле в Трис-глициновом буфере (0,025М Трис, 0,192М глицина, 0,1 % SDS). Буфер для образцов содержал 0,0625М Трис, 2,3 % SDS, 1 % 2-меркаптоэтанола, 10% глицерина, 0,05% бромфенолового синего. В качестве маркеров молекулярных масс использовали набор белков - маркеров производства фирмы «Sigma» (CША). По завершении электрофореза гель окрашивали в растворе, содержащем 0,1 % Кумасси R-250, 10 % уксусной кислоты и 25 % этилового спирта, несвязавшийся краситель отмывали в нескольких сменах раствора, содержащего 10 % уксусной кислоты и 25 % этилового спирта.

Вестерн-блоттинг

Иммобилизацию белков на нитроцеллюлозной мембране проводили по ранее описанному методу [Towbin, H. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications / H. Towbin, T. Staehelin, J. Gordon // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1979. – V.76. – N.9. – P.4350 – 4354] на приборе для электропереноса Trans-Blot Turbo Transfer System (Bio-Rad, США) по рекомендациям производителя. По окончании электропереноса контролировали его качество окрашиванием мембран в течение 5 минут 0,2 % раствором PONSO S в 3% растворе трихлоруксусной кислоты. Несвязавшийся с белками краситель отмывали дистиллированной водой. На фильтре отмечали положение белковых зон. Фильтры промывали три раза по 5 минут буфером TBS-T (20 мМ Трис-HCl pH 7,5, 150 мМ NaCl, 0,05 % Твин 20) до полного обесцвечивания. Затем нитроцеллюлозную мембрану с иммобилизованными белками инкубировали в течение 1 часа в блокирующем растворе, содержащем 5% сухого обезжиренного молока в буфере TBS-T. Затем мембрану инкубировали в течение 1 часа при +37°С с содержащей антитела к ВГЕ человеческой сывороткой в 100-кратном разведении в буфере ТBS-T с 5% лизата бактерий E.coli PLT90. После трехкратной промывки в буфере TBS-T фильтр инкубировали в растворе конъюгата моноклональных антител к Fc-фрагменту иммуноглобулинов IgG человека с пероксидазой хрена в течение 30 минут при +37°С и вновь три раза отмывали в буфере TBS-T. Реакцию проявляли субстратным раствором (0,04 % диаминобензидина и 0,003 % H2O2 в растворе 50 мМ Трис-HCl pH7,5) в течение 15-20 минут при комнатной температуре без доступа света. Реакцию останавливали, промывая мембрану водой.

Непрямой иммуноферментный анализ с сыворотками крови человека проводили на иммуносорбенте, полученном с помощью сорбции рекомбинантных антигенов ORF2 и ВГЕ 1 и 3 генотипов и ORF2 ВГЕ 3 генотипа и мозаичного рекомбинантного полипептида ORF2/3_ВГЕ1/3 в концентрации 0,75 мкг/мл в 60 мМ карбонат-бикарбонатном буфере рН 9,6 (КББ) в лунках 96-луночных полистироловых планшетов («Costar», США) в течение 16 часов при температуре +4°С. Исследуемые образцы сывороток крови разводили в соотношении 1:10 в растворе 0,01 М фосфатно-солевого буфера (ФСБ) pH 7,5, содержащего 0,05% Твина-20 и 0,9% казеина, - и вносили в соответствующие лунки планшетов с сорбированными рекомбинантными антигенами. Инкубировали в течение 30 минут при температуре +37°С и промывали 3 раза с помощью автоматического устройства для промывания планшет «WellWash» (BioRad, США). Наличие или отсутствие связывания антител с изучаемыми рекомбинантными белками выявляли с помощью конъюгированных с пероксидазой хрена моноклональных антител к IgG человека. Для этого 100 мкл рабочего разведения (1:30000) пероксидазного конъюгата моноклональных антител мыши к IgG человека в 0,1 М ФСБ pH 7,5, содержащем 0,05% Твин-20 и 0,9% казеина, вносили в каждую лунку, инкубировали полчаса при температуре +37°С и промывали 3 раза. Затем в каждую лунку вносили по 100 мкл индикаторного раствора, содержащего субстрат и хромоген - 3,3',5,5'-тетраметилбензидин, и инкубировали в течение 15 минут при комнатной температуре, поместив в защищенное от света место. Реакцию останавливали путем внесения во все лунки по 100 мкл 0,5М раствора серной кислоты. Оптическую плотность раствора в каждой лунке измеряли при двух длинах волн 450 нм и 620 нм с помощью спектрофотометра Multiscan GO (Thermoscientific, США). Для оценки результатов рассчитывали уровень ОП критического для мозаичного полипептида и каждого из рекомбинантных белков по формуле: среднее значение ОП отрицательных сывороток плюс трехкратное стандартное отклонение (σ).

Непрямой иммуноферментный анализ с сыворотками крови иммунизированных кроликов проводили с использованием рекомбинантных антигенов ORF2 и ВГЕ 1 и 3 генотипов и ORF2 ВГЕ 3 генотипа и мозаичного рекомбинантного полипептида ORF2/3_ВГЕ1/3, сорбированных в концентрации 0,75 мкг/мл в 10 мМ карбонат-бикарбонатном буфере рН 9,6 в лунках 96-луночных полистироловых планшетов («Costar», США) в течение 16 часов при температуре +4°С. Из используемых препаратов кроличьих антител (α1.9.11.15, α1.63.06.18, α1.84.01.18, α1.54.11.19) готовили серии разведений от 1:200 до 1: 204800 с 4-кратным шагом в растворе ФСБ pH 7,5, содержащем 0,05% Твин-20, 0,9% казеина и вносили в лунки планшетов с иммуносорбентами. Инкубировали в течение 30 минут при температуре +37°С и промывали 3 раза с помощью автоматического устройства «WellWash» (BioRad, США). Наличие или отсутствие связывания препаратов антител с изучаемыми рекомбинантными белками выявляли с помощью конъюгированных с пероксидазой хрена козьих поликлональных антител к IgG кролика (P-GAR Iss). Для этого 100 мкл рабочего разведения (1:5000) конъюгата в ФСБ pH 7,5, содержащем 0,05% Твин-20 и 0,9% казеина, вносили в каждую лунку, инкубировали полчаса при температуре +37°С и промывали 3 раза. Затем в каждую лунку вносили по 100 мкл индикаторного раствора, содержащего субстрат и хромоген - 3,3',5,5'-тетраметилбензидин, и инкубировали в течение 15 минут при комнатной температуре, поместив в защищенное от света место. Реакцию останавливали внесением во все лунки по 100 мкл 0,5М раствора серной кислоты. Оптическую плотность раствора в каждой лунке измеряли при двух длинах волн 450 нм и 620 нм с помощью спектрофотометра Multiscan GO (Thermoscientific, США).

Для проведения ИФА в иммунометрическом формате рекомбинантный полипептид ORF2/3_ВГЕ1/3 по 1,0 мкг/мл сорбировали в 60 мМ КББ в лунках 96-луночных полистироловых планшетов («Costar», США) в течение 16 часов при температуре +4°С. Предварительно готовили серии разведений кроличьих антител (α1.9.11.15, α1.63.06.18, α1.84.01.18, α1.54.11.19, β1.46.04.19) от 1:200 до 1: 204800 с 4-кратным шагом в ФСБ pH 7,5, содержащем 0,05% Твин-20, 0,9% казеина. По 10 мкл каждого разведения и по 90 мкл пероксидазного конъюгата ORF2/3-ВГЕ1/3 [1:16000] последовательно вносили в каждую лунку иммуносорбента. Для разведения конъюгата использовали ФСБ pH 7,5, содержащий 0,05% Твин-20, 0,9% казеина. Заполненный иммуносорбент инкубировали в течение 60 минут при температуре +37°С и промывали 5 раз с помощью автоматического устройства «WellWash» (BioRad, США). В каждую лунку вносили по 100 мкл индикаторного раствора, содержащего субстрат и хромоген - 3,3',5,5'-тетраметилбензидин, и инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре, поместив в защищенное от света место. Реакцию останавливали путем внесения во все лунки по 100 мкл 0,5 М раствора серной кислоты. Оптическую плотность раствора в каждой лунке измеряли при двух длинах волн 450 нм и 620 нм с помощью спектрофотометра Multiscan GO (Thermoscientific, США).

Описание ряда методов, условий постановки эксперимента, состав питательных сред и растворов приводятся при изложении полученных результатов.

Результаты

В процессе работ получен фрагмент ДНК, содержащий нуклеотидные последовательности участков генов orf2 и orf3 ВГЕ 1 и 3 генотипов, кодирующий рекомбинантный белок, содержащий диагностически значимые эпитопы белков ORF2 и ORF3 ВГЕ 1 и 3 генотипов в виде одной полипептидной цепи со следующей аминокислотной последовательностью:

MetGlyArgGlySerAsnGlyGluProThrValLysLeuTyrThrSerValGluAsnAla

GlnGlnAspLysGlyIleAlaIleProHisAspIleAspLeuGlyAspSerArgValVal

IleGlnAspTyrAspAsnGlnHisGluGlnAspArgProThrProSerProAlaProSer

ArgProPheSerValLeuArgAlaAsnAspValLeuTrpLeuSerLeuThrAlaAlaGlu

TyrAspGlnThrThrTyrGlySerSerThrAsnProMetTyrValSerAspThrValThr

PheValAsnValAlaThrGlyAlaGlnAlaValAlaArgSerLeuAspTrpSerLysVal

ThrLeuAspGlyArgProLeuThrThrIleGlnGlnTyrSerLysThrPheTyrValLeu

ProLeuArgGlyLysLeuSerPheTrpGluAlaGlyThrThrLysAlaGlyTyrProTyr

AsnTyrAsnThrThrAlaSerAspGlnIleLeuIleGluAsnAlaAlaGlyHisArgVal

AlaIleSerThrTyrThrThrSerLeuGlyAlaGlyProValSerValSerAlaValGly

ValLeuAlaProHisSerAlaLeuAlaValLeuGluAspThrIleAspTyrProAlaArg

AlaHisThrPheAspAspPheCysProGluCysArgAsnLeuGlyLeuGlnGlyCysAla

PheGlnSerThrValAlaGluLeuGlnArgLeuLysMetLysValGlyLysThrArgGlu

SerGlySerGluPheAsnGlyGluProThrValLysLeuTyrThrSerValGluAsnAla

GlnGlnAspLysGlyIleAlaIleProHisAspIleAspLeuGlyGluSerArgValVal

IleGlnAspTyrAspAsnGlnHisGluGlnAspArgProThrProSerProAlaProSer

ArgProPheSerValLeuArgAlaAsnAspValLeuTrpLeuSerLeuThrAlaAlaGlu

TyrAspGlnSerThrTyrGlySerSerThrGlyProValTyrValSerAspSerValThr

LeuValAsnValAlaThrGlyAlaGlnAlaValAlaArgSerLeuAspTrpThrLysVal

ThrLeuAspGlyArgProLeuSerThrIleGlnGlnTyrSerLysThrPhePheValLeu

ProLeuArgGlyLysLeuSerPheTrpGluAlaGlyThrThrLysAlaGlyTyrProTyr

AsnTyrAsnThrThrAlaSerAspGlnLeuLeuValGluAsnAlaAlaGlyHisArgVal

AlaIleSerThrTyrThrThrSerLeuGlyAlaGlyProValSerIleSerAlaValAla

ValLeuAlaProHisSerAlaLeuAlaLeuLeuGluAspThrMetAspTyrProAlaArg

AlaHisThrPheAspAspPheCysProGluCysArgProLeuGlyLeuGlnGlyCysAla

PheGlnSerThrValAlaGluLeuGlnArgLeuLysMetLysValGlyLysThrArgGlu

LeuGluPheGluLeuMetGlySerProCysAlaLeuGlyLeuPheCysCysCysSerSer

CysPheCysLeuCysCysProArgHisArgProAlaSerArgLeuAlaAlaValValGly

GlyAlaAlaAlaValProAlaValValSerGlyValThrGlyLeuIleLeuSerProSer

ProSerProIlePheIleGlnProThrProLeuProProThrSerTyrHisAsnProGly

LeuGluLeuAlaLeuAspSerArgProAlaProSerAlaProLeuGlyValThrSerPro

SerAlaProProLeuProProValValAspLeuProGlnLeuGlyLeuArgArgIlePhe