L международная выставка-презентация
научных, технических, учебно-методических и литературно-художественных изданий
Способ биофабрикации трансплантата в виде клеточных сфероидов для регенеративных технологий восстановления хряща субъекта на основе надхрящницы собственного реберного хряща субъекта и мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга этого же субъекта
| Название | Способ биофабрикации трансплантата в виде клеточных сфероидов для регенеративных технологий восстановления хряща субъекта на основе надхрящницы собственного реберного хряща субъекта и мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга этого же субъекта |
|---|---|
| Разработчик (Авторы) | Ковалев Алексей Вячеславович |
| Вид объекта патентного права | Изобретение |
| Регистрационный номер | 2800991 |
| Дата регистрации | 01.08.2023 |
| Правообладатель | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр травматологии и ортопедии имени Н.Н. Приорова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ТО им. Н.Н. Приорова" Минздрава России) |
| Область применения (класс МПК) | C12N 5/077 (2010.01) |
| Медаль имени А.Нобеля |  |
Описание изобретения
Изобретение относится к области регенеративной медицины и раскрывает способ получения трансплантата в виде клеточных сфероидов для восстановления хряща субъекта, который включает в себя выделение клеток из камбиального слоя надхрящницы собственного реберного хряща и мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток собственного костного мозга субъекта, раздельное культивирование выделенных клеток в 2D-системах на дне культуральных флаконов, перенесение клеток в пластиковые микропланшеты из расчета 8000 клеток на 1 лунку, причем клетки двух клеточных культур смешиваются в соотношении клеток 1:1, и их последующее 3D-культивирование в лунках с образованием клеточных сфероидов. Изобретение позволяет получать трансплантат с выраженным регенерационным потенциалом, эффектом стимуляции регенерации окружающего хряща и антимикробной активностью, для эффективного восстановления хряща, в частности суставного хряща, возможно использование полученных сфероидов для биопечати. 6 з.п. ф-лы, 1 пр.
Изобретение относится к области медицины, а именно к тканевой инженерии, трансплантологии, регенеративной медицине, травматологии и ортопедии, пластической хирургии и стоматологии.
Уровень техники
Гиалиновая хрящевая ткань - это наиболее распространенный вид хрящевых скелетных тканей в организме человека, которая образует скелет у плода (образует временный эмбриональный скелет, который постепенно заменяется костью), дыхательные пути и т.д., в постнатальном периоде развития человека гиалиновая хрящевая ткань представлена в реберных хрящах, хрящах носа, гортани (частично), трахеи и крупных бронхов, покрывает все суставные поверхности костей, хрящевые пластинки роста в трубчатых костях. Способность к репаративной регенерации гиалинового хряща связана с наличием надхрящницы, в тех органах, где она покрывает хрящ. Надхрящница представляет собой плотную богатую сосудами соединительнотканную оболочку, присутствует на растущей кости (на этапе энхондрального остеогенеза при внутриутробном развитии), реберного хряща, хрящей гортани и дыхательных путей и т.д. Надхрящница является источником камбиальных клеток, служит для роста и регенерации хрящевой ткани. Полноценная регенерация гиалинового хряща после травматических повреждений возможна, в случаях повреждений хрящей, покрытых надхрящницей и при обязательном сохранении последней после разрушения хряща. Прехондробласты надхрящницы активируются при повреждениях, делятся и дифференцируются в хондробласты, которые способны вырабатывать тканеспецифическое межклеточное вещество хряща, заполняя хрящевым регенератом свободное пространство посттравматического дефекта. Однако, тканеспецифическая регенерация хряща под надхрящницей не всегда возможна из-за опережающего развития другого регенерата из окружающей молодой волокнистой соединительной ткани, которая быстрее замещает пространство дефекта хряща, со временем превращаясь из рыхлой волокнистой соединительной ткани в атипичный регенерат - соединительнотканный рубец. Условием органотипичной регенерации хряща под надхрящницей является сохранение ее целостности, эта соединительнотканная пластинка должна быть сомкнута, а все ее повреждения ушиты. Этот атипичный регенерат имеет иные прочностные характеристики, слабо связан с волоконным остовом интактного окружающего хряща, часто повреждается и нарушает функции хрящевой ткани суставов.
Суставной хрящ лишен надхрящницы. Поэтому по-прежнему преобладает точка зрения, что организм взрослого человека не способен производить новую гиалиновую хрящевую ткань после травматических дефектов или при остеоартрите на суставных поверхностях костей, в том числе после повреждений хрящевой ткани отдельно или вместе с формирующих суставную поверхность костной тканью. Суставной хрящ имеет сниженный регенеративный потенциал в постнатальном периоде развития, так как в этой ткани не много скелетных стволовых клеток, которые можно было бы активировать, они не могут эффективно противодействовать кумулятивным повреждениям, таким как повышенные нагрузки на суставы, а также травмам, которые приводят к разрушению хряща и развитию остеоартрита. В суставном хряще обнаружены различные клетки, претендующие на роль стволовых клеток/ клеток-предшественников хрящевого происхождения (cartilage-derived stem/progenitor cells (CSPCs), articular cartilage-derived progenitor cells (ACPCs) находящиеся в зрелом хряще, а также прогениторные клетки в бороздке Ранвье хряща и других внутрисуставных тканях, которые потенциально способны участвовать в регенерации хряща. Взрослый суставной хрящ имеет ограниченную способность к восстановлению, хондроциты связаны лакунами и не могут мигрировать в поврежденные участки, деление клеток внутри хряща происходит очень медленно, дефекты хряща часто прогрессируют до остеоартрита.
Потенциал для восстановления гиалинового хряща ограничен отсутствием сосудов и нервов в хряще, невозможностью поступления клеток-эффекторов воспаления и клеток-предшественников с током крови, а также относительно небольшим количеством и низкими митогенными характеристиками хондроцитов, расположенных в плотном внеклеточном матриксе. Хрящевых клеток в суставном хряще не более 5%. Остальное пространство занимает внеклеточный матрикс, богатый коллагеном и протеогликанами.
Исторически регенеративная способность суставного хряща и в целом гиалиновых хрящей после окончания внутриутробного периода развития подвергалась сомнению, в том числе, из-за медленной скорости обновления хрящевого матрикса, особенно волоконного остова - коллагена хрящей. Период полураспада белков матрикса суставного хряща (коллагенов), очень велик (более 20 лет), что свидетельствует о низкой интенсивности обновления хрящевого матрикса. Однако, установлено, что физиологическая регенерация хряща у людей продолжается после наступления половой зрелости и прекращения роста на протяжении всей жизни человека. В разных частях тела физиологическая регенерация хрящей идет с разной скоростью. Например, в голеностопном суставе эта ткань обновлялась намного быстрее, чем в коленном, а в тазобедренном суставе более медленно (Ming-Feng Hsueh, Patrik Onnerfjord, Michael P. Bolognesi, Mark E. Easley, Virginia B. Kraus. Analysis of "old" proteins unmasks dynamic gradient of cartilage turnover in human limbs. Science Advances, 2019; 5 (10): eaax3203 DOI: 10.1126/sciadv.aax3203).
Регенеративная способность неповрежденного суставного хряща у человека была продемонстрирована клиническими исследованиями, при дистракции сустава у взрослых пациентов наблюдающими очевидное увеличение ширины суставной щели и толщины хряща на рентгенограммах (Interna F., Van Roermund P. M., Marijnissen А. С.A., Cotofana S., Eckstein F., Castelein R. M., Bijlsma J. W. J., Mastbergen S. C, Lafeber F. P. J. G., Tissue structure modification in knee osteoarthritis by use of joint distraction: An open 1-year pilot study. Ann. Rheum. Dis. 70, 1441-1446 (2011)).
С 1994 года в клинической практике применяются двухэтапные процедуры, известные как имплантация аутологичных хондроцитов (autologous chondrocytes transplantation), которые, как было показано в различных рандомизированных исследованиях, обеспечивают стойкое клиническое улучшение у пациентов с дефектами суставного хряща. Известны три поколения этой методики. В третьем поколении хондроциты культивировали в 3D условиях без использования каких-либо каркасных материалов (3D-ACI, three-dimensional autologous chondrocyte implantation), предлагая полную аутологичность трехмерной (3D) трансплантации, которая сама по себе может быть осуществлена более щадящим способом - артроскопически. Для этого клетки культивировали в высокой плотности, где хондроциты образуют так называемые сфероиды - клеточные агломераты округлой формы (хондросферы), которые состоят только из собственных хондроцитов пациента и образуемой ими внеклеточной матрицы, которая синтезируется самими хондроцитами в 3D культуре, является важной и неотъемлемой частью хондросфер.
Недостатками всех этих поколений технологии имплантации аутологичных хондроцитов является необходимость проведения двух последовательных операций на суставе. Первая операция связана с забором кусочков здоровой части хряща с не нагружаемой поверхности для выделения клеток и наращивания их количества в лабораторных условиях для последующей аутологичной трансплантации. Известно, что стойкое повреждение структурной организации суставного хряща (дефект на месте забора не восстанавливается спонтанно) приводит к изменению распределения сил и потере механической прочности, подобный забор может иметь определенные отрицательные последствия. Вторая операция включает трансплантацию клеточного материала для замещения дефектов хряща. Пациент обречен на два послеоперационных периода, требуются вспомогательные устройства для передвижений, длительная реабилитация. Используются собственные хондроциты хряща, пролиферативный потенциал которых ограничен и эти клетки частично теряют свою тканеспецифичность при культивировании. Известно, что экспансия (размножение) хондроцитов ограничена после удвоения популяции в культуре, так как эти клетки имеют тенденцию приобретать фибробластоподобный вид и терять свой хрящевой фенотип, прежде чем стать стареющими.
Разрабатываются новые варианты этой техники, совсем недавно предложен вариант с использованием биопсии хряща носа, чтобы обойти необходимость предварительного забора аутологичного хряща в коленном суставе. К недостаткам технологии относят строгие правила государственной регистрации, дополнительная травма носа, небольшое количество биоптата для экспансии, что требует большего количества митозов, высокие затраты и сложная логистика, связанные с расширением ex vivo для последующей имплантации человеку, которые ограничивают широкую доступность и этого вида аутологичной клеточной имплантации (хондроцитов)........
Формула изобретения
1. Способ биофабрикации трансплантата в виде клеточных сфероидов для регенеративных технологий восстановления хряща субъекта на основе клеток надхрящницы собственного реберного хряща субъекта и мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга этого же субъекта, характеризующийся тем, что выделяют адгезивные клетки из камбиального слоя надхрящницы собственного реберного хряща субъекта, выделяют адгезивные стромальные клетки из собственного костного мозга субъекта, осуществляют раздельное культивирование выделенных клеток в адгезивных 2D-культурах без хондрогенной дифференцировочной среды, при этом для получения первичной культуры выделенные клетки высевают в пластиковые флаконы с культуральной средой следующего состава: DMEM или DMEM /F12 450 мл, L-глутамин 292 мг, тромболизат PLTGold® Human Platelet Lysate, Merck - 50 мл, пенициллин 100 ед/мл, стрептомицин 100 мкг/мл, при 100% влажности, температуре 37°С, газовая смесь с 5% содержанием СО2, переносят полученные клетки в NanoCulture® плиты для 3D-культивирования Corning® 1536-луночный микропланшет для сфероидов с круглым дном и сверхнизким прикреплением, с крышкой, стерильный Corning® 1536-well Black/Clear Round Bottom Ultra-low Attachment Spheroid Microplate, with Lid, Sterile и последующее 3D культивирование с образованием клеточных сфероидов, при этом производят смешанное культивирование клеток надхрящницы и МСК в соотношении 1:1 в количестве 8000 клеток на лунку.
2. Способ по п. 1, в котором субъект представляет собой человека.
3. Способ по п. 1, в котором хрящ представляет собой суставной хрящ, хрящ носа, гортани, трахеи, бронхов, ушной раковины или межпозвоночных дисков.
4. Способ по п. 1, в котором культивирование адгезивных стромальных клеток из собственного костного мозга субъекта, а также раздельное культивирование выделенных адгезивных клеток из камбиального слоя надхрящницы собственного реберного хряща субъекта осуществляют в течение 20-30 дней.
5. Способ по п. 1, в котором перенесение клеток на стадии раздельного культивирования выделенных клеток осуществляют из расчета 8000 клеток надхрящницы и МСК в соотношении 1:1 на 1 лунку агарозного планшета.
6. Способ по п. 1, в котором слияние клеток в клеточные сфероиды осуществляют в лунках пластикового микропланшета, где клетки пребывают до 6 дня.
7. Способ по п. 1, в котором размер сфероидов составляет 420-450 мкм.
Медаль Альфреда Нобеля