Способ получения трансплантата - тканеинженерной надхрящницы на основе клеточных сфероидов

Название	Способ получения трансплантата - тканеинженерной надхрящницы на основе клеточных сфероидов
Разработчик (Авторы)	Ковалев Алексей Вячеславович
Вид объекта патентного права	Изобретение
Регистрационный номер	2807692
Дата регистрации	21.11.2023
Правообладатель	Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр травматологии и ортопедии имени Н.Н. Приорова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ТО им. Н.Н. Приорова" Минздрава России)
Область применения (класс МПК)	C12N 5/077 (2010.01) A61K 35/12 (2015.01)
Медаль имени А.Нобеля

Описание изобретения

Область техники

Изобретение относится к области медицины, а именно к тканевой инженерии, регенеративной медицине, ортобиологии, травматологии и ортопедии, отоларингологии, пластической и восстановительной хирургии.

Уровень техники

Одной из актуальных проблем медицины является регенерация хрящевой ткани, большой практический интерес представляет восстановление любых дефектов гиалиновых хрящей, так как хрящевая ткань обладает крайне ограниченной способностью к спонтанной регенерации в условиях утраты надхрящницы или же при ее отсутствии в норме, например, у суставных гиалиновых хрящей нет надхрящницы. Значение надхрящницы как для физиологической, так и для репаративной регенерации, а также роста хрящей и хрящевых основ костей является основополагающим. В качестве примера, у детей и подростков надхрящница необходима для правильного формирования и роста хрящевой основы черепа (висцерального отдела), что должно обязательно учитываться при проведении реконструктивных операций в области головы и шеи с необходимостью восстановления целостности надхрящницы при хирургии этой области и лечении травм. Регенеративный потенциал надхрящницы является перспективой для разработки новых стратегий тканевой инженерии хрящей и хрящевых тканей (Gvaramia D, Kern J, Jakob Y, Zenobi-Wong M, Rotter N. Regenerative Potential of Perichondrium: A Tissue Engineering Perspective. Tissue Eng Part В Rev. 2021 Jun 30. doi: 10.1089/ten.TEB.2021.0054. Epub ahead of print. PMID: 33966486).

Перспективными строительными блоками для разработки новых методов тканевой инженерии скелетных тканей являются клеточные сфероиды, которые представляют собой клеточные агрегаты округлой формы. При 3D-культивировании клеток в составе сфероидов, например, некоторые стволовые клетки взрослых и клетки соединительной ткани синтезируют внеклеточный матрикс, воссоздавая в искусственных условиях выращивания новые структуры на тканевом уровне (клеточные агрегаты имеют способность накапливать внутри себя элементы внеклеточного матрикса). Сфероиды из стволовых клеток взрослых могут быть рассмотрены как органоиды, поскольку стволовые клетки повторяют пути дифференцировки, и являются перспективной живой моделью тех или иных тканей или органов вне организма для выявления новых молекулярных мишеней (биомаркеров) для диагностики и разработки новых методов терапии. Сфероиды представляют собой новый развивающийся и перспективный подход к клеточной трансплантации, установлено, что клетки в составе сфероидов более успешно приживляются и интегрируют в организм реципиента, сфероиды могут участвовать в регенеративных гистогенезах, что нехарактерно для клеточных трансплантатов в виде суспензии отдельных разрозненных клеток, для которых более характерно проявление паракринного эффекта на окружающие ткани реципиента в области пересадки - сценарий медицинских сигнальных клеток. Сфероиды могут быть непосредственно пересажены в область постравматических дефектов, либо в комбинации с различными биоматериалами. Клетки, мигрирующие из сфероидов, могут выходить из сфероида и распространяться на поверхность каркаса, причем сфероиды могут взаимодействовать с каркасами (матрицами, скаффолдами) в разных условиях эксперимента in vitrum, в искусственных лабораторных условиях на тканевых или органных культурах, либо при закреплении каркаса-матрицы на реципиентной поверхности в организме-реципиента на живой модели. Сфероиды крайне важны для развития методов биопечати, являются для биопринтинга строительными блоками, продуктами тканевой инженерии, могут входить в состав биочернил. Образуемые конструкции, в которых сфероид взаимодействует со скаффолдом-каркасом, исследуются, уже доказано, что клетки сфероидов мигрируют в каркас от места прилипания сфероида, а сфероиды, например, из стволовых клеток взрослых, вероятно, могут быть использованы для оптимизации клеточной колонизации в скаффолдах для инженерии хрящей и костной ткани (Baptista LS, Kronemberger GS, Cortes I, Charelli LE, Matsui RAM, Palhares TN, Sohier J, Rossi AM, Granjeiro JM. Adult Stem Cells Spheroids to Optimize Cell Colonization in Scaffolds for Cartilage and Bone Tissue Engineering. Int J Mol Sci. 2018 Apr 25;19(5): 1285. doi: 10.3390/ijmsl9051285. PMID: 29693604; PMCID: PMC5983745).

Известен способ выращивания новой гиалиновой хрящевой ткани в искусственных условиях тканевой культуры, который может быть использован в качестве прототипа. В этом способе коллагеновые матрицы заворачивали в слой надхрящницы. Матрица служит носителем для обеспечения миграции клеток из надхрящницы в матрикс матрицы. Условия тканевого (3D) культивирования в питательной среде полученного конструкта стимулировали рост и пролиферацию клеток. Клетки мигрировали в поры матрикса (матрицы), где они выживают и синтезируют компоненты матрикса, включая коллаген 2-го типа. Было показано при гистологическом исследовании, что после 4 недель культивирования происходит увеличение количества клеточных слоев вокруг матрикса, а также количество клеток, мигрировавших в пористый матрикс матрицы. Иммуногистохимическое окрашивание этих культивируемых клеток показало экспрессию коллагена типа II, в том числе обнаруженное и внутриклеточно, что является одним из доказательств неохондрогенеза, так как процесс синтеза коллагена II типа является фенотипическими признаками хондроцита (van Lange JW, de Roo K, Middelkoop E, van den Bos T, Everts V, Nolst Trenite GJ. Perichondrium-wrapped collagenous matrices to induce chondroneogenesis: an in vitro study. Arch Facial Plast Surg. 2001 Apr-Jun;3(2): 122-6. doi: 10.1001/archfaci.3.2.122. PMID: 11368666).

Известен способ неоморфогенеза хряща путем выращивания бычьих хондроцитов в тесной взаимосвязи с биоразлагаемыми полимерами, состоящими из полигликолевой кислоты и поли-L-молочной кислоты. В этом способе полимерные матрицы засевают свежевыделенными бычьими суставными хондроцитами, а затем имплантируют подкожно голым (иммунодефицитным) мышам. Макроскопическое исследование вырезанных образцов через 12 недель после имплантации (ксенотрансплантации клеток на носителе) выявило наличие нового гиалинового хряща примерно тех же размеров, что и исходная конструкция для подкожного введения из биоразлагаемого полимера. Этот хрящ не проявлял признаков резорбции или разрастания в течение 12 недель эксперимента (Kim W.S., Vacanti J.P., Cima L., Mooney D., Upton J., Puelacher W.C., Vacanti C.A. Cartilage engineered in predetermined shapes employing cell transplantation on synthetic biodegradable polymers. Plast Reconstr Surg. 1994 Aug;94(2):233-7; discussion 238-40. PMID: 8041813).

На настоящий момент установлено, что спонтанное восстановление хряща на месте его посттравматического дефекта часто отсутствует или является неполным, это обычно медленно текущий процесс. Причины неспособности хрящевой ткани к репаративной регенерации исследуются, считают, что вероятно связаны с особенностями структуры и физиологической природы этой бессосудистой и узкоспециализированной скелетной ткани, содержащей ограниченное количество хондроцитов с медленным их обновлением при физиологической регенерации, как клеточной составляющей. Медленно обновляется и матрикс гиалинового хряща. Продолжаются разработки имплантатов с живыми аутологичными клетками, которые, во-первых, должны быть доступны для практического здравоохранения получаемыми; во-вторых, должны обладать, как минимум, всеми преимуществами аутогенного хряща, например, как при мозаичной хондропластике. Подобные более совершенные, но полученные искусственным путем, тканеинженерные конструкции или живые эквиваленты хрящей активно разрабатываются.

Один из важнейших способов добиться результата в регенеративной медицине скелетных тканей - изучить спонтанную репаративную регенерацию скелета, условия, при которых она возможна и происходит естественным путем, это так называемый биомиметический подход. При этом подходе создаются устройства и способы, в которых достижение технических результатов по восстановлению тканей возможны на основе заимствований идей и основных элементов осуществления механизмов органотипичной репаративной либо физиологической регенерации из живой природы.

В гистологии и хирургии давно известно, что реберный хрящ человека способен к полноценной регенерации при определенных условиях. Условием реализации способности гиалинового хряща к полноценному восстановлению на месте посттравматических дефектов с утратой части хрящевой массы этой части ребра является сохранение целостности надхрящницы, покрывающей реберный хрящ в виде чехла, либо наложение швов, восстанавливающих анатомическую форму надхрящницы этот самый покровный чехол, что очень важно для предотвращения врастания регенератов окружающих мягких тканей под надхрящницу. При наличии крупных отверстий в надхрящнице регенераты мягких тканей вместе с новообразованными сосудами быстро заполняют дефект хряща, постепенно превращаясь из рыхлой волокнистой ткани в атипичный соединительнотканный регенерат - рубец, при этом нормальная структура и функции реберного хряща не восстанавливаются, пожизненно остается дефект этого органа. Для регенерации хряща под надхрящницей важно наличие и поддержание свободного пространства для развития полноценного репаративного регенерата. Создание специальных пространств, в которых происходит развитие регенератов, часто осуществляется с помощью ин виво биореакторов.

Регенерация хряща под надхрящницей осуществляется благодаря наличию в ней камбиальных элементов. Содержащиеся в надхрящнице стволовые клетки и прехондробласты активируются, пролиферируют и дифференцируются в хондробласты, которые вырабатывают межклеточное вещество хряща, постепенно заполняющее образовавшийся дефект полноценным регенератом. Очень важно сохранять надхрящницу во время хирургического вмешательства для адекватного послеоперационного заживления и сохранения хряща. Надо отметить, что клеточные и молекулярные механизмы полноценной репаративной регенерации реберного хряща человека исследованы недостаточно.

Известна животная модель посттравматического восстановления реберного хряща на примере реберного хряща у лабораторных мышей. В известных исследованиях показано, что полная замена резецированного хряща происходит быстро (в течение 1-2 месяцев), клетки регенерата правильно дифференцируются, но обращено внимание, что восстановление происходит спонтанно только при сохранении надхрящницы специальными хирургическими приемами в ходе создания экспериментального дефекта реберного хряща (Srour М. K., Fogel J. L., Yamaguchi K.T., Montgomery A. P., А. K Izuhara, A. L Misakian, S. Lam, Lakeland D.L., M. M Urata, J. S Lee, F. V Mariani Natural Large-Scale Regeneration of Rib Cartilage in a Mouse Model/ J Bone Miner Res. 2015 Feb;30(2):297-308. https://doi.org/10.1002/jbmr.2326).

В экспериментах на крысах установлено, что надхрящница, пересаженная в дефекты суставного хряща, не только стимулировала регенерацию, но и сама интегрировалась в состав регенератов на хрящевых суставных поверхностях. Трансплантаты надхрящницы развились в суставоподобный гиалиновый хрящ (Dou Z, Muder D, Baroncelli M, Bendre A, Gkourogianni A, Ottosson L, Vedung T, Nilsson O. Rat perichondrium transplanted to articular cartilage defects forms articular-like, hyaline cartilage. Bone. 2021 Oct; 151:116035. doi: 10.1016/j.bone.2021.116035. Epub2021 Jun 8. PMID: 34111644)..................

Формула изобретения

1. Способ получения трансплантата - тканеинженерной надхрящницы на основе клеточных сфероидов, включающий следующие этапы:

а) размещение на дне культурального сосуда с боковой крышкой листа лиофилизированной децеллюляризованной донорской надхрящницы и ее пропитывание культуральной питательной средой,

б) установка титановой рамы с размером сечения бруска рамы, боковая сторона которого 0,5 мм, а длина составляет 4 мм, скрепленных между собой под прямым углом сверху на лиофилизированную децеллюляризованную донорскую надхрящницу,

в) укладка горизонтального слоя из клеточных сфероидов, состоящих из агрегированных культивированных аутологичных клеток надхрящницы, в один ряд, из расчета 4 клеточных сфероида на 1 мм2 поверхности лиофилизированной децеллюляризованной донорской надхрящницы,

г) культивирование сфероидов при созревании тканеинженерной конструкции на поверхности лиофилизированной децеллюляризованной донорской надхрящницы в питательной среде ДМЕМ или ДМЕМ/F12 450 мл, L-глутамин 292 мг, эмбриональная телячья сыворотка 50 мл, пенициллин 100 ед/мл, стрептомицин 100 мкг/мл, при условии 100% влажности над слоем питательной среды внутри культурального флакона, в которую вносится культуральная добавка для индукции хондрогенной дифференцировки MSCgo ™Chondrogenic Differentiation Supplement Mix Biological Industries, США, в количестве 3 мл добавки на 100 мл питательной среды в течение 5 суток с ежедневной заменой питательной среды,

д) замена ранее установленной титановой рамы с размерами сечения бруска рамы боковой стороны 0,5 мм на 4 мм, скрепленных между собой под прямым углом, на титановую раму с размером сечения бруска 0,65 мм на 4 мм, причем внутренние размеры проема второй и первой рамы одинаковые, частичный слив культуральной питательной среды,

е) заполнение с помощью шприца пространства, ограниченного верхними краями титановой рамы и ее внутренними боковыми стенками, гелем на основе гиалуроновой кислоты с сураминсодержащими липосомами, с помощью планки производится выравнивание слоя геля по верхним краям титановой рамы.

2. Способ по п. 1, в котором субъект представляет собой человека.

3. Способ по п. 1, в котором сфероиды состоят из культивированных адгезивных клеток камбиального слоя надхрящницы в количестве 6000 клеток на сфероид или клеточных сфероидов, состоящих из мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга в соотношении 2:1 в количестве 6000-8000 клеток на сфероид.

4. Способ по п. 1, в котором донорская надхрящница представляет собой ксеногенную надхрящницу быка, или ксеногенную надхрящницу овцы, или ксеногенную надхрящницу кролика, или аллогенную надхрящницу человека.

5. Способ по п. 1, в котором размер сфероидов составляет от 250 до 600 мкм.

Изобретение "Способ получения трансплантата - тканеинженерной надхрящницы на основе клеточных сфероидов" (Ковалев Алексей Вячеславович) отмечено юбилейной наградой (25 лет Российской Академии Естествознания)
Медаль Альфреда Нобеля

Оформление наградных документов и заказ каталога