Способ повышения эффективности цефтриаксона в отношении офтальмологических штаммов P.aeruginosa

Название	Способ повышения эффективности цефтриаксона в отношении офтальмологических штаммов P.aeruginosa
Разработчик (Авторы)	Самойлов Александр Николаевич, Анисимова Анастасия Алексеевна, Каюмов Айрат Рашитович, Фёдорова Марина Сергеевна, Тризна Елена Юрьевна
Вид объекта патентного права	Изобретение
Регистрационный номер	2843039
Дата регистрации	07.07.2025
Правообладатель	Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Казанский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации
Область применения (класс МПК)	C12N 7/00 (2006.01) A61P 31/04 (2006.01)

Описание изобретения

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, и предназначено для повышения эффективности цефтриаксона в отношении офтальмологических штаммов P.aeruginosa.

В настоящее время бактериальный кератит является одной из самых распространенных причин слепоты в молодом возрасте, особое место среди них занимает синегнойный кератит, как одна из самых агрессивных форм. Несмотря на все современные достижения антибактериальной терапии, нет 100% эффективных препаратов против синегнойной палочки [Szczotka-Flynn L.B., Shovlin J.P., Schnider C.M., Caffery B.E., Alfonso E.C., Carnt N.A., Chalmers R.L., Collier S., Jacobs D.S., Joslin C.E., Kroken A.R., Lakkis C., Pearlman E., Schein O.D., Stapleton F., Tu E., Willcox M.D.P. American Academy of Optometry Microbial Keratitis Think Tank. Optom Vis Sci. 2021 Mar 1; 98 (3): 182-198]. Ситуация осложняется тем, что зачастую антибактериальные препараты, имеющиеся в большинстве больниц обладают минимальной активностью в отношении P.aeruginosa.

Применение бактериофага совместно с антибиотиком способно значительно снизить бактериальную нагрузку, особенно в биопленках P.aeruginosa, в которых антибиотики обычно неэффективны. Бактериофаги (или фаги) - это вирусы, которые специфически инфицируют и уничтожают бактерии. Они являются естественными патогенами для определенных бактериальных штаммов и могут быть использованы для борьбы с бактериальными инфекциями. Фаги идентифицируют специфические рецепторы на поверхности бактерий и проникают внутрь, используя клеточные механизмы для репликации. В итоге происходит лизис бактерии, что позволяет освободить новые вирусные частицы, которые могут инфицировать другие клетки.

Применение антибиотиков совместно с бактериофагами представляет собой перспективную альтернативу традиционным методам лечения, особенно в условиях растущей резистентности бактерий к лекарственным препаратам. [Fukuda K., Ishida W., Uchiyama J., Rashel M., Kato S., Morita T., Muraoka A., Sumi T., Matsuzaki S., Daibata M., Fukushima A. Pseudomonas aeruginosa keratitis in mice: effects of topical bacteriophage KPP12 administration. PLoS One. 2012; 7 (10): e47742. doi: 10.1371/journal.pone.0047742. Epub 2012 Oct 17. PMID: 23082205; PMCID: PMC3474789].

Задачей данного изобретения является создание способа повышения эффективности цефтриаксона в отношении офтальмологических штаммов P.aeruginosa.

Техническим результатом заявленного способа является повышение лизиса офтальмологических штаммов P.aeruginosa.

Технический результат достигается за счет того, что бактериофаг псеудомонас аеругиноса (НПО Микроген) лизирует часть бактерий, снижая тем самым бактериальную нагрузку и повышая восприимчивость синегнойной палочки к цефтриаксону (т.е. цефтриаксон и бактериофаг Микроген проявляют синергизм).

Преимуществом применения комбинации «цефтриаксон+бактериофаг псеудомонас аеругиноса (НПО Микроген)» является её высокая эффективность в отношении офтальмологических штаммов синегнойной палочки (лизис бактерий P.aeruginosa), возможность её применения при заболеваниях, вызванных данным возбудителем.

Детали, признаки, а также преимущества настоящего изобретения следует из нижеследующего описания реализации заявленного технического решения с использованием фигур, на которых показано:

Фиг. 1 - Оценка чувствительности клинического изолята P.aeruginosa 17 к бактериофагу «псеудомонас аеругиноса (НПО Микроген)» с помощью точечного теста. Во всех разведениях прозрачные зоны лизиса без вторичного бактериального роста.

Фиг. 2 - Оценка чувствительности клинического изолята P.aeruginosa 18 к бактериофагу «псеудомонас аеругиноса (НПО Микроген)» с помощью точечного теста. Во всех разведениях прозрачные зоны лизиса без вторичного бактериального роста.

Фиг. 3 - Выделено красной рамкой - применение цефтриаксона (АБ) и совместное применение цефтриаксона и бактериофага псеудомонас аеругиноса (МГ) на офтальмологическом штамме 17.

Фиг. 4 - Выделено красной рамкой - применение цефтриаксона (АБ) и совместное применение цефтриаксона и бактериофага псеудомонас аеругиноса (МГ) на офтальмологическом штамме 18.

Розовое окрашивание лунок - лунки, в которых присутствуют живые бактерии P.aeruginosa.

Синее окрашивание лунок - лунки, в которых нет живых бактерий P.aeruginosa.

Способ осуществляется следующим образом.

Методом микроразведений в среде LB (англ. Lysogeny broth - лизогенная среда) производится двойное разведение в жидкой питательной среде в 96-луночном пластиковом планшете (Eppendorf) в концентрациях цефтриаксона от 0,5 до 512 мкг/мл. Лунки засеваются 200 мкл бактериальной культуры (количество КОЕ составляет ~ 5×106) в среде LB. Затем в лунки добавляется 10 мкл бактериофага псеудомонас аеругиноса (НПО Микроген). После этого планшеты инкубируются при 37°C. Эффективность оценивается по окрашиванию каждой лунки резазурином.

Определение минимальной подавляющей концентрации цефтриаксона (МПК)

Минимальная ингибирующая концентрация исследуемых веществ определяется методом микроразведений в среде LB. Производится двойное разведение в жидкой питательной среде в 96-луночном пластиковом планшете (Eppendorf) в концентрациях от 0,5 до 1024 мкг/мл (концентрация антибиотика снижается слева направо). Лунки засеваются 200 мкл бактериальной культуры (количество КОЕ составляет ~ 5×106) в среде LB и инкубируются при 37°C. Минимальная подавляющая концентрация определяется, как наименьшая концентрация антибактериального препарата, при которой полностью отсутствует бактериальный рост на 24 час инкубации. Опыт проводится в трех независимых повторностях.

Оценка чувствительности бактерий к бактериофагу

Способность фага лизировать каждый клинический изолят тестировали с помощью точечного теста, как описано Fong et al., с размером капли 5 мкл [Fong et al., 2009] (Фиг. 1; Фиг. 2). Для этого на чашки с агаризованной питательной средой наносили 3 мл полужидкого агара, содержащего 30 мкл ночной культуры бактерии. После застывания среды на чашки наносили 5 мкл фагового лизата с концентрацией не менее 105 БОЕ/мл. Цифры на чашках Петри 1-10 - десятикратные разведения фага: 1 - разведение 10 в 1 степени фагового лизата, 10 - 10 в 10 степени фагового лизата. После высыхания, чашку переворачивали и инкубировали при 37°С в течение 24 ч. Далее проводили оценку чувствительности клинических изолятов P.aerugoinosa к бактериофагу по пятибалльной шкале согласно методическим рекомендациям «РАЦИОНАЛЬНОЕ ПРИМЕНЕНИЕ БАКТЕРИОФАГОВ В ЛЕЧЕБНОЙ И ПРОТИВОЭПИДЕМИЧЕСКОЙ ПРАКТИКЕ» (по количеству «крестов»): «-» отсутствие литической активности; «+» - низкая активность (сплошной рост изолированных колоний бактерии на месте капли); «++» - зона лизиса с большим количеством колоний вторичного роста (более 15 колоний на месте капли); «+++» - зона лизиса с единичными колониями вторичного роста (до 15 колоний на месте капли); «++++» - прозрачная зона лизиса без колоний вторичного роста. На всех представленных фотографиях прозрачная зона лизиса без колоний вторичного роста.

Штамм 17 (Фиг. 1)

Штамм 18 (Фиг. 2)

Формула изобретения

Способ повышения эффективности цефтриаксона в отношении офтальмологических штаммов P.aeruginosa, включающий засев 200 мкл бактериальной культуры P.aeruginosa в лунки 96-луночного пластикового планшета с двукратно разведенным раствором цефтриаксона в жидкой питательной среде в концентрации от 1024 до 0,5 мкг/мл, затем в лунки добавляют 10 мкл бактериофага псевдомонас аеругиноза, планшет инкубируют при температуре 37°C, а эффективность оценивают по окрашиванию каждой лунки резазурином: розовое окрашивание лунок - присутствуют живые бактерии P.aeruginosa; синее окрашивание лунок - не присутствуют живые бактерии P.aeruginosa.

Изобретение "Способ повышения эффективности цефтриаксона в отношении офтальмологических штаммов P.aeruginosa" (Самойлов Александр Николаевич, Анисимова Анастасия Алексеевна, Каюмов Айрат Рашитович, Фёдорова Марина Сергеевна, Тризна Елена Юрьевна ) отмечено юбилейной наградой (25 лет Российской Академии Естествознания)
Медаль Альфреда Нобеля

Оформление наградных документов и заказ каталога