Средство и способ для раннего контрастного магнитно-резонансного томографического выявления злокачественных глиальных опухолей с питающими их сосудами в эксперименте

Название	Средство и способ для раннего контрастного магнитно-резонансного томографического выявления злокачественных глиальных опухолей с питающими их сосудами в эксперименте
Разработчик (Авторы)	Брусенцов Н.А., Бочарова О.А., Полянский В.А., Пирогов Ю.А., Анисимов Н.В., Гуляев М.В., Никитин П.И., Никитин М.П.
Вид объекта патентного права	Изобретение
Регистрационный номер	2655303
Дата регистрации	24.05.2018
Правообладатель	Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ)
Область применения (класс МПК)	A61K 49/00 (2006.01) A61K 49/06 (2006.01) A61B 5/055 (2006.01) B82B 3/00 (2006.01)

Описание изобретения

Область техники

Изобретение относится к экспериментальной медицине и касается получения средства и способа для раннего контрастного магнитно-резонансного томографического (МРТ) выявления злокачественных глиальных опухолей с питающими их сосудами в эксперименте.

Уровень техники

Известны комбинации контрастных МРТ нанопрепаратов: аскорбатферрит-магневист (АФ-МВ), цитратферрит-магневист (ЦФ-МВ) и способ обнаружения сосудов, питающих опухоль [патент РФ №2382596, опубликовано 27.02.2010, кл. А61В 5/055, A61K 49/06]. На 6-14 день после прививки аденокарциномы молочной железы Са755, последовательно вводят в хвостовую вену комбинации: АФ-МВ или ЦФ-МВ. Контрастные МРТ изображения сосудов, питающих капсулу и опухоль аденокарциномы молочной железы Са755, визуализируют через 3,0-30,0 час после введения АФ-МВ или ЦФ-МВ [Брусенцов Н.А., Пирогов Ю.А., Брусенцова Т.Н., Учеваткин А.А., Никитин П.И., Никитин М.П. и др. Выявление сосудов, питающих опухоль. Российский биотерапевтический журнал, 9(4), с. 6, 2010].

Недостатки способа обнаружения сосудов, питающих опухоль:

- неустойчивость золей АФ и СФ в полиглюкине;

- окисление Fe2+ до Fe3+, которое приводит к уменьшению удельной намагниченности (Ms) магнитных наночастиц (МН) АФ-МВ и ЦФ-МВ, изменению их физико-химических свойств, с утратой визуализации сосудов, питающие опухоль, при КМРТ сканировании молочной железы на 3-5 день после прививки аденокарциномы Са755;

Прототипом способа синтеза МРТ контрастного средства для выявления глиальных опухолей с питающими их сосудами является способ синтеза декстранферрита [Гуляев М.В., Пирогов Ю.А., Брусенцова Т.Н., Брусенцов Н.А. Синтез декстранферрита и раннее магнитно-резонансное томографическое выявление опухоли, капсулы и сосудов, питающих опухоль, в эксперименте in vivo. Сборник тезисов докладов участников Второго международного форума по нанотехнологиям 6-8 октября 2009. Нанотехнологии в медицине. Онкология и кардиология, с. 9-11].

К недостаткам способа синтеза декстранферрита относят:

- неустойчивость золей магнетита, которые спонтанно окисляются и агрегируют в водной среде;

- окисление Fe2+ до Fe3+ в нанокристаллах магнетита, которое приводит к уменьшению удельной намагниченности (Ms) и изменению физико-химических свойств;

- неустойчивость золей декстранферрита в полиглюкине, которая приводит к образованию микротромбов в крови.

Прототипом способа раннего контрастного МРТ выявления злокачественных глиальных опухолей является метод контрастного МРТ сканирования мозга на 7-14 день после прививки с внутривенным (ВВ) введением комбинации декстран магнетит-магневист (ДМ-МВ) крысам, с получением магнитно-резонансных T1, Т2 и Т2* взвешенных контрастных МРТ изображений глиальных опухолей [М.В. Гуляев, Н.В. Анисимов, Г.М. Юсубалиева, Н.А. Брусенцов, А.А. Самойленко, Ю.А. Пирогов. Применение методов ЯМР в исследованиях глиальных опухолей у лабораторных животных. Технологии живых систем, 10(1), с. 35-40 (2013)].

К недостаткам данного способа выявления злокачественных глиальных опухолей относят позднюю визуализацию контрастных МРТ изображений злокачественных глиом, которая происходит лишь на 7-14 день после прививки.

Ранняя визуализация контрастных МРТ изображений злокачественных глиом с питающими их сосудами, после ВВ или интраперитонеального (ИП) введения комбинации ДМ-МВ на 3-5 день после прививки не происходит.

Магнитные наночастицы ДМ в полиглюкине неустойчивы при хранении в виде золей, они быстро слипаются и выпадают в осадок. Кроме того, в составе ДМ содержатся ионы Fe2+, которые окисляются кислородом воздуха. При окислении Fe2+ до Fe3+ уменьшается намагниченность МН ДМ и изменяются физико-химические свойства.

Раскрытие изобретения

Задачей изобретения является создание средства и способа для раннего (на 3-4 день после прививки) контрастного МРТ выявления злокачественных глиальных опухолей с питающими их сосудами.

Техническим результатом является избирательно увеличивающее число вокселей для ранней контрастной МРТ визуализации взвешенных 3D контрастных МРТ изображений путем понижения сигнала протонов нормальных тканей до гипоинтенсивного и повышения сигнала протонов опухолевых глиальных тканей с питающими их сосудами до гиперинтенсивного через 3-4 дня после прививки, что на 3-4 дня раньше известных способов выявления глиальных опухолей.

Технический результат достигается за счет средства способа. Средство получают следующим способом: смесь Fe(OH)2, Fe(OH)3 и Со(ОН)2 при следующем соотношении компонентов: 1,1÷1,3:1,7÷1,9:0,1, нагревают при рН 11-12 в отсутствии кислорода при перемешивании; полученные нанокристаллы нестехиометрического магнетита общей формулы (1)

,

высаживают в неоднородном постоянном магнитном поле, полученную суспензию активируют концентрированной хлористоводородной кислотой до получения прозрачного светло-желтого раствора, далее полученные нанокристаллы обрабатывают декстраном до образования устойчивого в течении 15-30 минут золя в магнитном поле при 0,2-3,0 Тл, градиент 0,003 Тл/см - 0,04 Тл/см и получают допированный Со2+ декстранферрит общей формулы (2): .

Активацию концентрированной хлористоводородной кислотой проводят при рН 1,2-1,4.

Высаживание в неоднородном постоянном магнитном поле проводят при 0,2-3,0 Тл, градиент 0,003 Тл/см - 0,04 Тл/см.

Способ раннего обнаружения сосудов, питающих опухоль, включающий контрастное МРТ сканирование головного мозга, осуществляют следующим образом: за 10 мин - 48 ч до контрастного МРТ сканирования головного мозга, внутривенно или внутриартериально вводят 2-5% водный раствор допированного Со2+ декстранферрита общей формулы (2):

взятого из расчета 0,1-0,2 мл на 100 грамм веса, а за 3-6 мин до начала сканирования внутривенно вводят магневист из расчета 0,1-0,2 мл/кг и затем осуществляют визуализацию T1, Т2 и Т2* взвешенных 3D изображений злокачественных глиальных опухолей.

Осуществление изобретения

Способ получения допированного ионами кобальта (Со2+) декстранферрита (ДФСо2+) включает нагрев смеси Fe(OH)2, Fe(OH)3 и Со(ОН)2 при следующем соотношении компонентов: 1,1-1,3:1,7-1,9:0,1, с допустимой величиной погрешности, при рН 11-12 в отсутствии кислорода при перемешивании получают нанокристаллы нестехиометрического магнетита общей формулы (1)

,

полученные нанокристаллы высаживают в неоднородном постоянном магнитном поле. Полученную суспензию активируют концентрированной хлористоводородной кислотой до получения прозрачного светло-желтого раствора, далее полученные нанокристаллы обрабатывают декстраном до образования устойчивого в течении 15-30 минут золя в магнитном поле при 0,2-3,0 Тл, градиент 0,003 Тл/см - 0,04 Тл/см и получают дотированный Со2+ декстранферрит общей формулы (2)

.

где r - общее число магнитных кластеров допированного Со2+ нестехиометрического магнетита (зависит от объема и концентрации реакционной смеси);

m - количество активированных молекул допированного Со2+ нестехиометрического магнетита от 5 до 35%;

r-m - количество неактивированных молекул допированного Со2+ нестехиометрического магнетита от 95 до 65%

f - число остатков глюкозы в молекуле декстрана, имеющих прямые химические связи с молекулами допированного Со2+ нестехиометрического магнетита от 5 до 35%;

общее число остатков молекул глюкозы в молекуле декстрана 432;

q-f - число остатков глюкозы, неимеющих химические связи с молекулами допированного Со2+ магнетита от 95 до 65%

Заявляемое средство (ЗС) получают следующим образом

Водную суспензию смеси гидроксидов 1,2Fe(OH)2+1,8Fe(OH)3 (моль) перемешивают при рН 11-12, нагревают при 80°С и перемешивают до прекращения роста нанокристаллов вследствие понижения концентрации ионов железа, затем добавляют Со(ОН)2 и перемешивают 40 мин при 80-90°С. Получают водную суспензию черного цвета.

Далее суспензию очищают от исходных веществ в неоднородном постоянном магнитном поле (НПМП) индукцией 0,2 Тл, градиент 0,003 Тл/см. Получают допированный кобальтом нестехиометрический магнетит состава Fe2+1,2 Fe3+1,8O4 Co2+0,1O общей формулы:

,

который представляет собой нанокристаллы диаметром от 7 до 11 нм. Нанокристаллы активируют концентрированной хлористоводородной кислотой и обрабатывают декстраном.

Получают декстранферрит, допированный Со2+ (ДФСо2+), общей формулы (2):

где r - общее число магнитных кластеров допированного Со2+ нестехиометрического магнетита (зависит от объема и концентрации реакционной смеси); m - количество активированных молекул допированного Со2+ нестехиометрического магнетита от 5 до 35%;

r-m - количество неактивированных молекул допированного Со2+ нестехиометрического магнетита от 95 до 65%

f - число остатков глюкозы в молекуле декстрана, имеющих прямые химические связи с молекулами допированного Со2+ нестехиометрического магнетита от 5 до 35%;

q-f - число остатков глюкозы, не имеющих химические связи с молекулами допированного Со2+ магнетита от 95 до 65%.

Оно представляет собой кристаллическое вещество от темно-коричневого до черного цвета.

Далее лиофилизацией получают порошок, который в воде образует устойчивые коллоидные растворы.

ζ - потенциал наночастиц до покрытия декстраном соответствовал - 18 мВ, Т2 релаксивность (Relaxivity) 456 с-1млМ-1.

После покрытия ζ-потенциал наночастиц - 36 мВ. Релаксивность, отражающая способность контрастного МРТ препарата изменять времена протонной ядерной магнитной релаксации в зависимости от концентрации магнитных центров, понижалась после покрытия нанокристаллов декстраном до 410 с-1млМ-1.

В процессе физико-химического изучения ДФСо2+ определили два основных фактора, которые определяют усиление сигнала магнитного резонанса протонов воды в магнитном поле в присутствии контрастного препарата, ДФСо2+:

- ядро наночастицы из нестехиометрического магнетита (размер ядра и его химический состав);

- покрытие ядра наночастицы (толщина слоя и химический состав), которые могут повышать или понижать Т2 релаксивность за счет изменения интенсивности диффузии молекул воды в неоднородном магнитном поле, создаваемом МН.

Декстрановое покрытие понижает интенсивность диффузии молекул воды в неоднородном магнитном поле, создаваемом МН ДФСо2+.

Удельную намагниченность насыщения (Ms) ДФСо2+ 7,8 кА/м увеличивают введением в структуру ядра ионов Со2+, содержащих атомы с неспаренными электронами, удельная абсорбция энергии ((SAR) 280 Вт/г Fe).

Острая токсичность при внутривенном введении:

ЛД50 мышей C57B1/6j 1,03 г/кг; ЛД50 крыс Вистар 1,75 г/кг.

Декстранферрит допированный Со2+ образует устойчивые в течение 1 месяца водные золи, которые используют в качестве магнитных носителей для биомедицинских целей.

К настоящему времени решены многие технологические проблемы, связанные с технологией получения суперпарамагнитных наночастиц (СМН) [1-3]. Однако, до сих пор, не опубликована методика получения устойчивых водных золей суперпарамагнитных наночастиц нестехиометрического магнетита допированных ионами Со2+, покрытых декстраном.

Магнитные наночастицы ДФСо2+, успешно используемые in vivo, состоят из нестехиометрического магнетита (Fe3O4Co2+O), нестехиометрического магнетита (γ-Fe2O3 Со2+О) и применяются с учетом их магнитных свойств, низкой токсичности и известным путям метаболизма [1-4].

В основном СМН используются в биомедицинских исследованиях на культурах клеток и на линейных экспериментальных животных. Гидродинамический диаметр наночастиц от 30 до 700 нм. Полученный фильтрат декстранферрита, допированного ионами Со2+ (ДФСо2+), концентрируют на роторном испарителе. Получают 10% водный золь, рН 7,2, стерилизуют при температуре +100°С 1 час, разливают по 10 мл в стеклянные флаконы и используют по назначению или лиофилизируют.

Заявляемый способ осуществляют следующим образом:

- для анестезии крысам вводят интраперитонеально 0,01 г/кг «Zoletil 100», (фирмы Virbac);

- перед прививкой глиальных опухолей проводят предварительное контрастное МРТ сканирование головного мозга 4 нормальных крыс;

- находят участки мозга, в которые планируют имплантировать опухолевые клетки;

- определяют переносимые млекопитающими дозы МН ДФ и МН ЗС, достаточные для визуализации КМРТ изображений тканей мозга высокого разрешения и контраста;

- 2 крысам вводят ВВ от 0,1 до 1,0 мл/кг 5% золь МН декстранферрита в полиглюкине в комбинации с магневистом (МВ) (ДФ-МВ), другим 2 крысам вводят ВВ от 0,1 до 1,0 мл/кг 5% водный золь МН заявляемого средства в комбинации с магневистом (ЗС-МВ), от 0,1 до 0,2 мл/кг. Контрастным МРТ сканированием мозга визуализируют КМРТ изображения (КМРТИ), фиг. 1 (а, b);

- сравнивают информативность и качество КМРТ изображений нормального головного мозга, полученных с помощью ДФ-МВ и ЗС-МВ до прививки опухолей.

Внутрисосудистым введением ЗС-МВ визуализируют более информативные КМРТИ высокого разрешения и контраста, фиг. 1 (b).

Для разработки способа раннего, контрастного МРТ выявления злокачественных глиальных опухолей с питающими их сосудами отбирают 80 половозрелых самок крыс Вистар весом 180-200 г разводки вивария ФГБНУ "РОНЦ им Н.Н. Блохина", делят их на 2 партии 1 и 2, по 40 особей в каждой. Стереотаксически, в стерильных условиях 40 самкам крыс 1 партии имплантируют интрацеребрально на глубину 3 мм суспензию 106 жизнеспособных клеток глиобластомы 101/8 в 0,015 мл питательной среды 199 при рН 7,4.

Глиому С6 имплантируют 40 самкам крыс 2 партии и изучают развитие опухолей аналогично глиоболастоме 101/8.

Из 40 крыс Вистар с опухолями глиобластомы 101/8 выбирают 25 крыс, делят на 4 группы: 1, 2, 3, 4. В 1 контрольной группе - 10 крыс, в опытных группах - по 5 крыс.

Из 40 крыс Вистар с опухолями глиомы С6 выбирают 25 крыс, делят на 4 группы: 1', 2', 3', 4'. В 1' контрольной группе - 10 крыс, в опытных группах - по 5 крыс.

Через 72 час после прививки опухолей 10 крысам 1 и 10 крысам 1' контрольных групп до проведения раннего контрастного МРТ сканирования в период от 6 мин до 30 час внутривенно вводят 0,9% раствор NaCl от 0,1 до 1,0 мл/кг, проводят МРТ сканирование мозга. Мозг сканируют in vivo на биоспектротомографе (Bruker) в режимах получения Ti взвешенных {500/15 (время повторения, мс/время эхо, мс), Т2 взвешенных (1900/80) спин-эхо и Т2-взвешенных градиент-эхо (500/15)} изображений, Т2* взвешенных {500/15 [время повторения, мс/время эхо, мс]. МРТ изображения ранних форм глиальных опухолей не визуализируются, см. фиг. 2 (а', b'). Однако через 7-14 дней в местах прививки визуализируются МРТИ распространенных форм глиальных опухолей - фиг. 3 (а', b', с') и фиг. 4. В процессе МРТ сканирования мозга осуществляют мониторинг частоты сердечных сокращений и ритма дыхания крыс с помощью Model 1025 smol Animal Monitoring and Gating System (Operation Mammal SA Instruments, Inc.).

В опытных группах 2, 2'; 3, 3'; и 4, 4' за такой же период времени перед ранним контрастным МРТ сканированием внутривенно вводят:

- крысам 2, 2' групп от 0,1 до 0,2 мл/кг магневист;

- крысам 3, 3' групп от 0,1 до 2,0 мл/кг комбинации 5% золя декстранферрита в полиглюкине, магневист (МВ), (ДФ-МВ);

- крысам 4, 4' групп от 0,1 до 2,0 мл/кг комбинации 5% водного золя заявляемого средства и от 0,1 до 0,2 мл/кг - магневист, см. табл. 1.

Контрастные магнитно-резонансные томографические изображения (КМРТИ) глиальных опухолей визуализируют на 3-5 день после прививки опухоли внутрисосудистым введением комбинации заявленного средства с магневистом, фигуры: 5 (b'); 6 (b'); 7 (b); 8 (b); 9 (а', b', с', d'); 10 (a', b', с', d'); 11 (а, b, с); 12 (а', b', с'); 13 (а, b, с, d); 14 (a', b', с') и 15.

Через 60-168 час после прививки злокачественных глиальных опухолей, через 1-24 час после внутрисосудистого введения заявляемого средства в комбинации с МВ, мозг 50 самок крыс Вистар сканируют с визуализацией КМРТ изображений злокачественных глиальных опухолей, с питающими их сосудами. Визуализируют МРТ и КМРТ изображения мозга крыс с привитыми опухолями, которые точнее отражают изменения, тканей мозга, вызванные опухолевой малигнизацией, чем комбинации ДФ-МВ, фигуры 5 (b'), 6 (b'), 7 (b), 8 (b). Визуализируют МРТИ ранних, а также распространенных форм глиальных опухолей с питающими их сосудами 9 (а', b', с', d'); 10 (а', b', с', d'); 11 (a, b, с); 12 (а', b', с'); 13 (а, b, c, d); 14 (а', b', с'), 15.

Визуализируют КМРТ изображения ранних форм опухолей глиомы С6, фиг. 5 (а', b') и фиг. 6 (а', b') и глиобластомы 101/8, фиг. 7 (а, b) и фиг. 8 (а, b).

По результатам сравнения КМРТ изображений определяют, что ВВ введение магневиста или комбинации ДФ-МВ приводит к изображениям низкого контраста и разрешения, фигуры: 5 (а'); 6 (а'); 7 (а); 8 (а). ВВ введение комбинации ЗС-МВ приводит к МРТ изображениям высокого разрешения и контраста, фигуры: 5 (b'); 6 (b'); 7 (b); 8 (b).

Таким образом, внутрисосудистое введение комбинации ЗС-МВ визуализирует КМРТИ глиальных опухолей более высокого разрешения и контраста.......

Формула изобретения

1. Способ получения допированного ионами кобальта (Со2+) декстранферрита (ДФСо2+), характеризующийся тем, что смесь Fe(OH)2, Fe(OH)3 и Со(ОН)2 при следующем мольном соотношении компонентов: 1,1÷1,3:1,7÷1,9:0,1, нагревают при рН 11-12 в отсутствие кислорода при перемешивании;

- полученные нанокристаллы нестехиометрического магнетита общей формулы (1)

,

высаживают в неоднородном постоянном магнитном поле, полученную суспензию активируют концентрированной хлористоводородной кислотой до получения прозрачного светло-желтого золя, далее полученные нанокристаллы обрабатывают декстраном до образования устойчивого в течение 15-30 минут золя в магнитном поле при 0,2-3,0 Тл, градиент 0,003 Тл/см - 0,04 Тл/см, и получают допированный Со2+ декстранферрит общей формулы (2):

,

где r - общее число магнитных кластеров допированного Со2+ нестехиометрического магнетита, зависит от объема и концентрации реакционной смеси; m - количество активированных молекул допированного Со2+ нестехиометрического магнетита от 5 до 35%; r-m - количество неактивированных молекул допированного Со2+ нестехиометрического магнетита от 95 до 65%; f - число остатков глюкозы в молекуле декстрана, имеющих прямые химические связи с молекулами допированного Со2+ нестехиометрического магнетита от 5 до 35%; q-f - число остатков глюкозы, не имеющих химические связи с молекулами допированного Со2+ магнетита от 95 до 65%.

2. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что активацию концентрированной хлористоводородной кислотой проводят при рН 1,2-1,4.

3. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что высаживание в неоднородном постоянном магнитном поле проводят при 0,2-3,0 Тл, градиент 0,003 Тл/см - 0,04 Тл/см.

4. Способ раннего обнаружения сосудов, питающих опухоль, включающий контрастное МРТ сканирование головного мозга, характеризующийся тем, что за 10 мин - 48 ч до контрастного МРТ сканирования головного мозга внутривенно или внутриартериально вводят 2-5% водного золя допированного Со2+ декстранферрита по п. 1 общей формулы (γ-Fe3+2O3Co0,1O)r-m(Fe2O3Co0,1OFe)m(C6H9O5)f(C6H10O5)q-f,

где r - общее число магнитных кластеров допированного Со2+ нестехиометрического магнетита, зависит от объема и концентрации реакционной смеси; m - количество активированных молекул допированного Со2+ нестехиометрического магнетита от 5 до 35%; r-m - количество неактивированных молекул допированного Со2+ нестехиометрического магнетита от 95 до 65%; f - число остатков глюкозы в молекуле декстрана, имеющих прямые химические связи с молекулами допированного Со2+ нестехиометрического магнетита от 5 до 35%; q-f - число остатков глюкозы, не имеющих химические связи с молекулами допированного Со2+ магнетита от 95 до 65%.

из расчета 0,1-0,2 мл на 100 г веса, а за 3-6 мин до начала сканирования внутривенно вводят магневист из расчета 0,1-0,2 мл/кг и затем осуществляют визуализацию следующих взвешенных 3D изображений злокачественных глиальных опухолей: T1 взвешенное изображение {500/15} (время повторения, мс/время эхо, мс), Т2 взвешенное изображение {1900/80} спин-эхо, Т2* взвешенное изображение {500/15} (время повторения, мс/время эхо, мс).

Изобретение "Средство и способ для раннего контрастного магнитно-резонансного томографического выявления злокачественных глиальных опухолей с питающими их сосудами в эксперименте" (Брусенцов Н.А., Бочарова О.А., Полянский В.А., Пирогов Ю.А., Анисимов Н.В., Гуляев М.В., Никитин П.И., Никитин М.П. ) отмечено юбилейной наградой (25 лет Российской Академии Естествознания)
Медаль Альфреда Нобеля

Оформление наградных документов и заказ каталога