Способ предотвращения нарушения межклеточных контактов эндотелиоцитов при дисфункции эндотелия

Название	Способ предотвращения нарушения межклеточных контактов эндотелиоцитов при дисфункции эндотелия
Разработчик (Авторы)	Гребенчиков Олег Александрович, Кузовлев Артем Николаевич, Ершов Антон Валерьевич, Касаткина Ирина Сергеевна, Прокофьев Максим Дмитриевич, Мешков Михаил Алексеевич, Шабанов Аслан Курбанович
Вид объекта патентного права	Изобретение
Регистрационный номер	2741766
Дата регистрации	28.01.2021
Правообладатель	Федеральное Государственное Бюджетное Научное Учреждение "Федеральный Научно-Клинический Центр Реаниматологии и Реабилитологии" (ФНКЦ РР)
Область применения (класс МПК)	A61K 33/14 (2006.01) A61P 43/00 (2006.01)

Описание изобретения

Изобретение относится к медицине, а именно к средствам терапевтического воздействия, основным компонентом которых является хлорид лития (LiCl). Изобретение может быть использовано для дальнейшей разработки медикаментозных средств и способов лечения больных с патологическими состояниями, при которых наблюдается дисфункция эндотелия: синдром системного воспалительного ответа после обширных операций, оперативное вмешательство с использованием аппарата искусственного кровообращения, сочетанная травма, тяжелый сепсис и септический шок, синдром ишемии-реперфузии тканей при инсульте и инфаркте миокарда, сахарный диабет, метастазирование опухолей, отек легкого и острый респираторный дистресс-синдром, ожоговая болезнь и другие. Способ позволяет устранить эндотелиальную дисфункцию, уменьшить проницаемость эндотелия.

Уровень техники

Известен способ, описывающий антиапоптотический эффект на эндотелиоциты триметазидина модифицированного высвобождения (Миокардиальные цитопротекторы оказывают антиапоптотический эффект на эндотелиоциты сосудистой стенки / А.И. Инжутова // Кардиоваскулярная терапия и профилактика, 2010; 9(8): 29-32). Способ характеризуется тем, что прием модифицированного триметазидина активирует окислительное декарбоксилирование и усиливает аэробный гликолиз, нормализует функционирование ионных каналов мембран, препятствуя накоплению внутриклеточного Са2+, что проявляется уменьшением в крови содержания апоптотических эндотелиальных клеток.

Недостатками известного способа являются: необходимость длительного введения препарата (3 недели), что делает его неактуальным для пациентов, находящихся в критическом состоянии; отсутствие доказанного эффекта на функцию и структуру эндотелиоцитов; отсутствие специфической точки приложения по отношению к эндотелиоцитам.

Известен способ коррекции эндотелиальной дисфункции с помощью синергетической терапевтической композиции, содержащей аддитивную соль мельдония ацетилсалициловой кислоты в качестве корректора эндотелиальной дисфункции и ингибитор редуктазы HMG-CoA (LV14963 Corrector of endothelial dysfunction).

Недостатком данного способа является направленность его на профилактику и/или лечение тромбоза, а также тромботических состояний. При этом предложенный препарат не оказывает непосредственного влияния на эндотелиоциты, их контакты, а также на их протекцию. Более того, эффективность способа была положительно оценена на экспериментальной модели эндотелиальной дисфункции, воспроизводимой с помощью блокатора синтеза NO, что не является ключевым и/или единственным фактором развития дисфункции эндотелия.

Известен также способ предотвращения развития эндотелиальной дисфункции у пациентов, страдающих язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки, осложненной гипертонией, включающий введение антибактериальных, гипотензивных препаратов и донора оксида азота - тивортина (UA 44424 Method for prevention of endothelial disfunction development in patients suffering from the duodenum peptic ulcer complicated with hypertension).

Недостатками данного способа являются: ограничение его использования только для пациентов с язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки, осложненной гипертонией, содержание в схеме терапии лекарственных веществ, применение которых неприемлемо и противопоказано для пациентов с иной патологией, невозможность использования предложенного способа для пациентов с синдромом системного воспалительного ответа.

В качестве ближайшего аналога заявляемого изобретения может быть рассмотрен способ лечения эндотелиальной дисфункции путем введения даларгина в виде стерильного кристаллоидного раствора для инфузий (RU 2657416). Способ характеризуется тем, что для коррекции эндотелиальной дисфункции при синдроме полиорганной недостаточности при критических состояниях, при тяжелом сепсисе и септическом шоке, при синдроме системного воспалительного ответа после операций на сердце и сосудах, при синдроме ишемии-реперфузии при ишемическом инсульте и инфаркте миокарда, при отеке легкого и остром респираторном дистресс-синдроме раствор вводят в различные временные промежутки с различной длительностью внутривенно капельно из расчета 50-200 мкг*кг массы тела пациента.

Недостатками известного способа является невозможность достижения обозначенной в патенте концентрации 50-200 мкг*кг в клинической практике, потому что даларгин является пептидным препаратом и подвержен действию эндогенных пептидаз, согласно литературным данным он не обнаруживается в кровотоке через полчаса после введения. Таким образом, для поддержания концентрации даларгина в плазме крови требуется его непрерывная инфузия в дозе 50-200 мкг*кг*час, что десятикратно превышает максимально разрешенную суточную дозу (согласно инструкции производителей она составляет 20 мг)

Заявляемое изобретение направлено на решение задачи предотвращения нарушения межклеточных контактов эндотелиоцитов при дисфункции эндотелия у пациентов с критическими состояниями, сопровождающимися развитием системного воспалительного ответа.

Поставленная задача решается тем, что образование и увеличение межклеточных промежутков в монослое эндотелиальных клеток, возникающие вследствие уменьшения расщепления белка адгезионных межклеточных контактов VE-кадгерина и белка плотных межклеточных контактов клаудина в контактах эндотелиальных клеток, угнетения апоптоза эндотелиальных клеток, достигается за счет введения раствора LiCl в концентрации по крайней мере 1 ммоль/л за 1 час до токсического воздействия сыворотки.

Техническим результатом заявляемого способа является коррекция эндотелиальной дисфункции у пациентов с критическими состояниями, сопровождающимися системным воспалительным ответом за счет введения LiCl до воздействия патогенного фактора.

Раскрытие изобретения

Известно, что различные цитокины воспаления, например, TNF-α (Tumor Necrosis Factor α) вызывают расщепление VE-кадгерина - эндотелиального белка адгезионных контактов. Также при действии подобных провоспалительных агентов происходит деградация белков плотных контактов, например, клаудина. Протеолиз этих важнейших белков межклеточных контактов вызывает образование промежутков между клетками, что приводит к увеличению проницаемости и нарушению барьерной функции эндотелия. В крайних случаях, может развиться эндотелиальная дисфункция, которая в настоящее время считается одним из основных факторов развития полиорганной недостаточности при системном воспалительном ответе.

В результате экспериментальных исследований, проведенных авторами заявляемого способа, было установлено, что инкубация монослоя эндотелиальных клеток с 5%-ой токсичной сывороткой приводит к потере белка адгезионных контактов VE-кадгерина, а также вызывает уменьшение количества клаудина, одного из главных белков плотных (замыкающих) контактов эндотелия. Кроме того, при воздействии токсичной сыворотки наблюдается изменение формы клеток: они теряют правильную многоугольную форму, вытягиваются, между ними образовываются промежутки, поскольку разбираются еще и пучки периферических актиновых микрофиламентов. Такие изменения характерны для эндотелиальной дисфункции, сопровождающейся нарушением межклеточных контактов. Подобные эффекты не наблюдались при инкубации монослоя эндотелиальных клеток с 5%-ной телячьей эмбриональной сывороткой (контроль) и с 5% сывороткой здоровых людей. Таким образом, данная модель может рассматриваться как модель эндотелиальной дисфункции при системном воспалительном ответе in vitro.

Для изучения возможного ангиопротекторного эффекта LiCl в рамках данной модели были использованы следующие концентрации данного вещества: 0,01 ммоль/л, 0,1 ммоль/л, 1 ммоль/л, 10 ммоль/л.

По данным иммунофлуоресцентой микроскопии, инкубация с LiCl в концентрации 0,01 ммоль/л не предотвращает разборку клаудина (одного из главных белков плотных (замыкающих) контактов эндотелия), актина (основного белка цитоскелета) и VE-кадгерина (белка адгезионных контактов). Прединкубация с LiCl в концентрации 0,1 ммоль/л статистически незначимо предотвращает разборку клаудина (р>0,05), но в более высоких концентрациях (1 ммоль/л, 10 ммоль/л) практически полностью защищает эндотелиальный монослой от разрушения межклеточных контактов, возникающих под действием сыворотки пациентов с системным воспалительным ответом.

Указанный эффект достигается за счет коррекции эндотелиальной дисфункции путем создания конкурентного взаимодействия иона лития с сайтом связывания Mg2+ кофактора фермента GSK-3β, предотвращения разборки клаудина и VE-кадгерина в межклеточных контактах, уменьшения количества апоптотических клеток в монослое эндотелиальных клеток и фосфорилирования GSK-3β.

Преимуществом заявляемого способа, по сравнению с известными, является лечебное воздействие раствора LiCl, позволяющее нивелировать влияние патогенных факторов в виде субстанций, циркулирующих в крови у пациентов в критическом состоянии, сопровождающимся системным воспалительным ответом, на эндотелиоциты благодаря следующим аспектам:

- фосфорилирование GSK-3β;

- ингибирование разборки клаудина и VE-кадгерина в межклеточных контактах эндотелиоцитов;

- инактивация апоптоза в монослое эндотелиальных клеток линии Ea.hy 926;

- малая токсичность препаратов на основе ионов лития.

Авторами заявляемого способа были проведены экспериментальные исследования in vitro в условиях, максимально приближенных к клинической картине возникновения эндотелиальной дисфункции у пациентов в критическом состоянии, состоящие в том, что в питательную культуру с монослоем эндотелиальных клеток Ea.hy926 добавляли токсичную сыворотку от пациентов с системным воспалительным ответом.

Описание процедуры эксперимента

В эксперименте было использовано 30 образцов токсичной сыворотки (10 от пациентов с септическим шоком, 10 от пациентов с ожоговой болезнью, 10 от пациентов, перенесших оперативное вмешательство с использованием аппарата искусственного кровообращения).

По 5 образцов токсичной сыворотки от каждой группы пациентов использовали для исследования влияния токсичной сыворотки на эндотелиоциты без протекции (всего 15 образцов). В основной группе (15 образцов эндотелиальных клеток) за 1 час до введения токсичной сыворотки в культуру эндотелиальных добавляли LiCl.

В эксперименте также использовали 15 образцов сыворотки от практически здоровых доноров-добровольцев. Группы по возрасту и полу были сопоставимы.

Эндотелиальные клетки Ea.hy926 растили в среде DMEM (Gibco, USA) с 10% телячьей эмбриональной сывороткой - FBS (HyClone, USA) до монослоя. Затем клетки инкубировали в течение 3 часов при 37°С

- с сывороткой здорового человека (контроль),

- с сывороткой пациента с системным воспалительным ответом без добавления LiCl.

- с добавлением LiCl в конечных концентрациях 0,01 ммоль/л, 0,1 ммоль/л, 1 ммоль/л, 10 ммоль/л к сыворотке пациентов с системным воспалительным ответом.

LiCl добавляли за 1 час до введения в монослой эндотелиальных клеток токсичной сыворотки пациентов с системным воспалительным ответом.

После инкубации клетки промывали теплым раствором DMEM без сыворотки, а затем фиксировали 2%-ным раствором параформа и пермеабилизовывали 1%-ным раствором Triton Х-100. Фиксированные клетки окрашивали первичными антителами к VE-кадгерину (BD Biosciences, USA), а затем инкубировали с вторичными антителами, конъюгированными с флуоресцентным красителем Oregon Green 488 (Life Technologies, USA), а также с фаллоидином красным (Invitrogen, USA) и красителем Hoechst 33342 (Life Technologies, USA). Обработку изображений, полученных на флуоресцентном микроскопе, их количественный анализ проводили с помощью программ ImageJ 1.44р и MetaVue 4.6.

На Фиг. 1 представлены изображения, полученные путем иммунофлуоресцентной микроскопии эндотелиальных клеток Ea.hy926, инкубированных с различными концентрациями LiCl (указаны в моль/л) и обработанных 5%-ной сывороткой пациентов с системным воспалительным ответом.

Обозначения:

Актин - окраска клеток на актиновые микрофиламенты;

VE-кадгерин - окраска на белок межклеточных контактов VE-кадгерин;

Ядра - окраска ядер клеток;

1 - контроль;

2 - сыворотка пациента с системным воспалительным ответом;

3 - сыворотка пациента с системным воспалительным ответом+хлорид лития 0,01 ммоль/л;

4 - сыворотка пациента с системным воспалительным ответом+хлорид лития 0,1 ммоль/л;

5 - сыворотка пациента с системным воспалительным ответом+хлорид лития 1,0 ммоль/л.

На Фиг. 2 приведены данные флуоресцентной микроскопии, отражающие влияние LiCl в концентрации 0,01 ммоль/л, 0,1 ммоль/л, 1 ммоль/л, 10 ммоль/л на образование межклеточных промежутков монослоя эндотелиальных клеток под действием 5%-ных сывороток пациентов с системным воспалительным ответом.

Обозначения:

К - контрольная сыворотка FBS;

ЗД - сыворотка здоровых добровольцев;

С - сыворотка пациентов с системным воспалительным ответом;

С + литий - сочетание LiCl в указанных концентрациях с сывороткой пациентов с системным воспалительным ответом.

Результаты представлены в виде среднего значения со стандартным отклонением. * - р<0,05 по отношению к С.

Для количественной оценки изменения количества белка межклеточных контактов VE-кадгерина был использован Вестерн-блоттинг. Установлено, что инкубация с 5%-ной токсичной сывороткой примерно вполовину уменьшает количество VE-кадгерина в клеточных лизатах. Инкубация с LiCl защищает этот белок от расщепления в дозозависимой степени.

На Фиг. 3 представлены данные иммуноблот-анализа типичного эксперимента, отражающие влияние LiCl в концентрации 0,01 ммоль/л; 0,1 ммоль/л; 1 ммоль/л; 10 ммоль/л на расщепление белка адгезивных контактов VE-кадгерина.

Обозначения:

К - контрольная сыворотка FBS;

С - сыворотка пациентов с системным воспалительным ответом;

С + лития хлорид - сочетание LiCl в указанных концентрациях с сывороткой пациентов с системным воспалительным ответом;

ГАФД - контрольный белок глицеральдегидфосфатдегидрогеназа

На Фиг. 4 представлены данные флуоресцентной микроскопии, отражающие влияние LiCl в концентрации 0,01 ммоль/л, 0,1 ммоль/л, 1 ммоль/л, 10 ммоль/л на относительное количество белка адгезивных межклеточных контактов VE-кадгерина в монослое эндотелиальных клеток, обработанных 5%-ной токсичной сывороткой.

Обозначения:

К - контрольная сыворотка FBS;

ЗД - сыворотка здоровых добровольцев;

С - сыворотка пациентов с системным воспалительным ответом; С + литий - сочетание LiCl в указанных концентрациях с сывороткой пациентов с системным воспалительным ответом.

Результаты представлены в виде среднего значения со стандартным отклонением.

* - р<0,05 по отношению к С.

Для количественной оценки изменения количества белка плотных контактов клаудина был также использован Вестерн-блоттинг.Было установлено, что инкубация с LiCl также защищает этот белок от расщепления под действием сыворотки пациентов с системным воспалительным ответом в дозозависимой степени.

На Фиг. 5 представлены данные флуоресцентной микроскопии, отражающие влияние LiCl в концентрации 0,01 ммоль/л, 0,1 ммоль/л, 1 ммоль/л, 10 ммоль/л на относительное количество белка плотных межклеточных контактов клаудина в монослое эндотелиальных клеток, обработанных 5%-ной сывороткой пациентов с системным воспалительным ответом.

Обозначения:

К - контрольная сыворотка FBS;

ЗД - сыворотка здоровых добровольцев;

С - сыворотка пациентов с системным воспалительным ответом;

С + Литий - сочетание LiCl в указанных концентрациях с сывороткой пациентов с системным воспалительным ответом.

Результаты представлены в виде среднего значения со стандартным отклонением.

* - р<0,05 по отношению к С.

В процессе эксперимента изучалось также влияние сывороток пациентов с системным воспалительным ответом на апоптоз эндотелиальных клеток. Известно, что в норме in vivo эндотелий практически не подвергается апоптозу. Однако при системном воспалительном ответе количество апоптотических эндотелиальных клеток увеличивается. В моделях in vitro многие провоспалительные агенты, такие как LPS, TNF-α, IL-1, увеличивают апоптоз различных линий эндотелиальных клеток.

Авторами было достоверно установлено, что инкубация с 5%-ными сыворотками пациентов с системным воспалительным ответом приводит к значительному увеличению количества апоптотических клеток. LiCl в концентрации 0,01 ммоль/л не уменьшает количество апоптотических клетках. Прединкубация с LiCl в концентрации 0,1 ммоль/л статистически незначимо снижает уровень апоптоза. В то время как в более высоких концентрациях (1 ммоль/л, 10 ммоль/л) наблюдается достоверное снижение уровня апоптоза.

На Фиг. 6 представлены данные флуоресцентной микроскопии, отражающие влияние LiCl в концентрации 0,01 ммоль/л, 0,1 ммоль/л, 1 ммоль/л, 10 ммоль/л на уровень апоптоза эндотелиальных клеток, обработанных 5%-ной сывороткой пациентов с системным воспалительным ответом.

Обозначения:

К - контрольная сыворотка FBS;

ЗД - сыворотка здоровых добровольцев;

С - сыворотка пациентов с системным воспалительным ответом;

С + литий - сочетание LiCl в указанных концентрациях с сывороткой пациентов с системным воспалительным ответом.

Результаты представлены в виде среднего значения (%)±стандартное отклонение.

* - р<0,05 по отношению к С.

Поскольку киназа GSK-3β является основной сигнальной молекулой, участвующей в повреждении многих типов клеток, включая эндотелиальные, в процессе эксперимента было исследовано действие сыворотки пациентов с системным воспалительным ответом на уровень фосфорилирования данной киназы. Было показано, что сыворотка пациентов с системным воспалительным ответом почти не влияет на уровень фосфо-GSK-3β через 5 мин, 15 мин, 30 мин и 1 час после действия сыворотки и вызывает значительное, примерно на 60%, уменьшение уровня фосфо-GSK-3β через 2 и 4 часа. Это свидетельствует об активации GSK-3β при действии факторов крови из данной сыворотки на эндотелиальные клетки.

На Фиг. 7 представлены данные иммуноблот-анализа в различные временные точки после действия на клетки токсичной сыворотки или LiCl, отражающие результаты воздействия сыворотки пациента с системным воспалительным ответом и LiCl в концентрации 1 ммоль/л на фосфорилирование киназы GSK-3β в клетках эндотелия.

Обозначения: К - контрольная сыворотка FBS.

На Фиг. 8 представлены данные иммуноблот-анализа одного из экспериментов по действию токсичной сыворотки на уровень фосфо-GSK-3β. По оси ординат указано относительное количество (%) фосфорилированной киназы GSK-3β относительно общего белка в клетках.

Параллельно с вышеописанным опытом, было изучено действия LiCl в концентрации 1 ммоль/л на динамику фосфорилирования GSK-3β в эндотелиальных клетках. Было обнаружено, что LiCl в концентрации 1 ммоль/л вызывает значительное повышение уровня фосфо-GSK-3β уже через 15 мин после воздействия, и этот эффект сохранялся вплоть до 4 часов.

На Фиг. 9 представлены данные иммуноблот-анализа одного из экспериментов по действию LiCl в концентрации 1 ммоль/л на уровень фосфо-GSK-3B. По оси ординат указано количество (%) фосфорилированной киназы GSK-3β (Ser9) нормированное на тотальный клеточный белок.

При моделировании защиты клеток эндотелия от токсичной сыворотки с помощью LiCl было обнаружено, что прединкубация с LiCl в концентрации 1 ммоль/л в течение менее 1 часа, предотвращает инактивацию (дефосфорилирование) GSK-3β и наоборот, стимулирует ее фосфорилирование на временном интервале 1-4 часа после воздействия сыворотки.

На Фиг. 10 представлены данные иммуноблот-анализа в различных временных точках после совместного воздействия сыворотки больного с системным воспалительным ответом и LiCl в концентрации 1 ммоль/л на фосфорилирование киназы GSK-3β в клетках эндотелия (1 час прединкубации) и токсичной сыворотки (продолжительность инкубации указана над дорожками иммуноблота.

Обозначения: К - контрольная сыворотка FBS.

На Фиг. 11 представлены данные иммуноблот-анализа одного эксперимента по действию LiCl в концентрации 1 ммоль/л на уровень фосфо-GSK-3β в эндотелиоцитах в различные временные интервалы под действием токсической сыворотки. По оси ординат указано относительное количество (%) фосфорилированной киназы GSK-3β в клетках эндотелия, нормированное на тотальный клеточный белок.

К - контрольная сыворотка FBS.

Кроме того было изучено совместное действие сыворотки больного с системным воспалительным ответом и LiCl в концентрациях 0,01 ммоль/л, 0,1 ммоль/л, 1 ммоль/л, 10 ммоль/л на фосфорилирование GSK-3β в клетках эндотелия. Клетки эндотелия прединкубировали 30 мин с указанными концентрациями LiCl, а затем на них воздействовали токсичной сывороткой. Через два часа инкубации с токсичной сывороткой проводили иммуноблот-анализ, на Фиг. 12 представлены данные иммуноблот-анализа после двухчасовой инкубации с токсичной сывороткой.

Обозначения: К - контрольная сыворотка FBS;

С - сыворотка больного с системным воспалительным ответом.

На Фиг. 13 представлены данные иммуноблот-анализа одного из экспериментов на уровень фосфорилирования GSK-3β в клетках эндотелия. Было обнаружено, что LiCl предотвращает дефосфорилирование GSK-3β во всех исследованных концентрациях. При увеличении концентрации LiCl наблюдается дозозависимое повышение уровня фосфорилирования GSK-3β. По оси ординат указано относительное количество (%) фосфорилированной киназы GSK-3β в клетках эндотелия, нормированное на тотальный клеточный белок.

Таким образом достоверно установлено, что LiCl в концентрации не менее 1 ммоль/л предотвращает разборку клаудина и VE-кадгерина в межклеточных контактах, уменьшает количество апоптотических клеток в монослое эндотелиальных клеток линии Ea.hy 926 под действием токсичной сыворотки, что свидетельствует о протекторном эффекте LiCl на эндотелиальный барьер.

Обнаруженный способ протекции межклеточных контактов эндотелиоцитов при воздействии LiCl в концентрации не менее 1 ммоль/л имеет высокую практическую значимость, поскольку клиницисты в своей работе могут рассчитывать на коррекцию эндотелиальной дисфункции у пациентов с критическими состояниями, сопровождающимися системным воспалительным ответом.

Формула изобретения

Способ предотвращения нарушения межклеточных контактов эндотелиоцитов, заключающийся в том, что осуществляют введение хлорида лития в концентрации не менее 1 ммоль/л в монослой эндотелиальных клеток линии Ea.hy 926 за 1 час до токсического воздействия сыворотки крови человека.

Изобретение "Способ предотвращения нарушения межклеточных контактов эндотелиоцитов при дисфункции эндотелия" ( Гребенчиков Олег Александрович, Кузовлев Артем Николаевич, Ершов Антон Валерьевич, Касаткина Ирина Сергеевна, Прокофьев Максим Дмитриевич, Мешков Михаил Алексеевич, Шабанов Аслан Курбанович) отмечено юбилейной наградой (25 лет Российской Академии Естествознания)
Медаль Альфреда Нобеля

Оформление наградных документов и заказ каталога