КОНСОРЦИУМ МИКРООРГАНИЗМОВ Exiguobacterium mexicanum И Bacillus vallismortis ДЛЯ ОЧИСТКИ МЕРЗЛОТНЫХ ПОЧВ ОТ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕНИЙ

Название	КОНСОРЦИУМ МИКРООРГАНИЗМОВ Exiguobacterium mexicanum И Bacillus vallismortis ДЛЯ ОЧИСТКИ МЕРЗЛОТНЫХ ПОЧВ ОТ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕНИЙ
Разработчик (Авторы)	Ерофеевская Л.А.
Вид объекта патентного права	Изобретение
Регистрационный номер	2565817
Дата регистрации	24.09.2014
Правообладатель	Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт проблем нефти и газа Сибирского отделения Российской академии наук
Медаль имени А.Нобеля

Описание изобретения

Изобретение относится к охране окружающей среды, в частности к экологической биотехнологии, микробиологии, и может быть использовано при очистке почвенных экосистем от нефтезагрязнений.

Сущность изобретения: создан консорциум микроорганизмов, Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011 и Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017, взятых в соотношении 1:1, для очистки различных типов мерзлотных почв от нефтезагрязнений. Применение консорциума позволяет за два месяца осуществить деградацию нефтезагрязнения в мерзлотной почве в условиях сильнообводненной болотистой местности до 88,6%; в многолетнемерзлых грунтах в условиях равнинной местности - до 73,8%; в мерзлотно-таежной почве в условиях сильно залесенной местности - до 56,4%; в мерзлотных торфяниках - до 45,6% за тот же промежуток времени.

Аналоги изобретения

Известен биопрепарат «Путидойл» (1. Авторское свидетельство СССР №1076446, Штамм Pseudomonas putida 36, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. A1, C02F 3/34, В09С 1/10, C12N 1/20, C02F 3/34, C02F 101/32, C12N 1/20, C12R 1/40. Заявка: 3474745, 22.07.1982. Опубликовано: 28.02.1984. Заявитель: Западно-Сибирский научно-исследовательский геологоразведочный нефтяной институт. Авторы: Дядечко В.Н., Толстокорова Л.Е., Морозова Т.Н.), используемый для очистки почвы от нефтяных загрязнений. Биопрепарат создан на основе монокультуры бактерий Pseudomonas putida 36 (2. Дядечко В.Н., Толстокорова Л.Е., Гашев С.Н. и др. О биологической рекультивации нефтезагрязненных песочных почв Среднего Приобья // Почвоведение. - 1990, №9. - С. 148-151).

Недостатком данного штамма является то, что он растет и утилизирует нефть очень медленно и лишь при высокой температуре (28-42°С).

Известен биопрепарат "Бациспецин" (3. Авторское свидетельство SU №1743019. Штамм бактерий Bacillus sp. ВНИИСХМ №132 для получения препарата грибковых возбудителей болезней злаковых культур. С0, A01N 63/00, C12N 1/20. Заявка: 4767349/13, 03.10.1989. Опубликовано: 30.05.1994. Заявитель: Институт биологии Башкирского научного центра Уральского отделения АН СССР. Авторы: Мелентьев А.И., Усанов Н.Г., Логинов О.Н. Патентообладатель: ТОО "Новодекс"), используемый для рекультивации почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами. Биопрепарат создан на основе монокультуры бактерий Bacillus species 739 (4. Патент РФ №2077397. Способ рекультивации почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами. C1, В09С 1/10, С09K 3/32, C12N 1/20. Заявка: 93029534/13, 15.06.1993. Опубликовано: 20.04.1997. Заявитель: Товарищество с ограниченной ответственностью "Новодекс", Андресон Роза Карамовна. Авторы: Андресон Р.К., Хазиев Ф.Х., Дешура B.C., Багаутдинов Ф.Я., Бойко Т.Ф., Новоселева Е.И. Патентообладатель: Товарищество с ограниченной ответственностью "Новодекс", Андресон Роза Карамовна).

Недостатком штамма является его низкая эффективность, особенно в условиях высокого содержания нефтезагрязнения.

Известен штамм Flavobacterium tirrennicum (5. Авторское свидетельство SU №1409594, 1988 г. Штамм бактерий Flavobacterium tirrennicum, используемый для очистки подсланевых и промышленных сточных вод от нефти и нефтепродуктов. A1, C12N 1/20, C02F 3/34, C12N 1/20, C12R 1:20, C02F 3/34, C02F 101:32. Заявка: 4066152, 24.03.1986. Опубликовано: 15.07.1988. Заявитель: Институт микробиологии и вирусологии АН КАЗССР. Авторы: Новожилова М.И., Попова Л.Е., Недоводиева Т.П., Каламкарова Л.И.), который может разлагать углеводороды нефти. Недостатком штамма является то, что он осуществляет деструкцию нефтепродуктов только в воде и не способен осуществлять очистку мерзлотной почвы от нефти.

Известны штаммы Acinetronacter sp.НВ-1 (6. Патент RU №2077579. Штамм бактерий Acinetobacter species, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. C1, C12N 1/20, C02F 3/34, В09С 1/10, C12R 1/01, C12N 1/20, В09С 101/00. Заявка: 94043331/13, 06.12.1994. Опубликовано: 20.04.1997. Заявитель: Государственный научно-исследовательский институт прикладной микробиологии. Авторы: Жиркова Н.А., Кобелев B.C., Холоденко В.П. Патентообладатель: Государственный научно-исследовательский институт прикладной микробиологии.); Acinetronacter sp. JN-2 (7. Патент RU №2064017. Штамм бактерий Acinetobacter species ВКПМ В-5971, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. C1, C12N 1/20, C02F 3/34, В09С 1/10. Заявка: 93009595/13, 23.02.1993. Опубликовано: 20.07.1996. Заявители: Ушков С.Б., Ильинская Н. В. Авторы: Ушков С.Б., Ильинская Н. В. Патентообладатели: Ушков С.Б., Ильинская Н. В.); Pseudomonas alcaligenes Е7 (8. Патент RU №2134723. Штамм бактерий Pseudomonas alcaligenes Е7, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. C1, C12N 1/20, C02F 3/34, В09С 1/10, C12N 1/20, C12R 1:38. Заявка: 98105707/13, 25.03.1998. Опубликовано: 20.08.1999. Заявитель: Государственный научный центр прикладной микробилогии. Авторы: Ермоленко З.М., Холоденко В.П., Чугунов В.А. Патентообладатель: Государственный научный центр прикладной микробилогии) и Pseudomonas alcaligenes В-1 (9. Патент RU №2133770. Штамм бактерий Pseudomonas alcaligenes В-1, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. C1, C12N 1/20, C02F 3/34, В09С 1/10. Заявка: 98105709/13, 25.03.1998. Опубликовано: 27.07.1999. Заявитель: Государственный научный центр прикладной микробиологии. Авторы: Ермоленко З.М., Холоденко В.П., Чугунов В.А., Кобелев B.C., Акимова Н.А. Патентообладатель: Государственный научный центр прикладной микробиологии). Недостатком штаммов является то, что они утилизируют нефть при сравнительно высоких температурах.

Известен способ очистки почв и грунтов, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, с использованием олеофильного биопрепарата на основе ассоциации нефтеокисляющих микроорганизмов - Rhodococcus erythropolis ИЭГМ 708 и Rhodococcus ruber ИЭГМ 327 и биосурфактанта-Rhodococcus, отличающийся тем, что производят первоначальную обработку сильнозагрязненной почвы/грунта до достижения уровня остаточных нефтепродуктов 5-10 вес. % и последующее добавление органического разрыхлителя, олеофильный биопрепарат вносят в количестве не менее 10 л на 0,5-1,0 м³ почвы/грунта по меньшей мере один раз в неделю в течение первого месяца и в дальнейшем по меньшей мере один раз в месяц до окончания цикла биоремедиации в сочетании с периодическим рыхлением и увлажнением и дополнительно производят фиторемедиацию - засев многолетними травами (10. Патент RU 2193464. Способ биоремедиации почв и грунтов, загрязненных нефтью и нефтепродуктами. C1, В09С 1/10, C12N 1/26, C12N 1/26, C12R 1/01. Заявка: 2001130686/13, 14.11.2001. Опубликовано: 27.11.2002. Заявители: Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН, Общество с ограниченной ответственностью "ПермНИПИнефть". Авторы: Ившина И.Б., Костарев С.М., Куюкина М.С., Закшевская Л.В. Патентообладатели: Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН, Общество с ограниченной ответственностью "ПермНИПИнефть"). Однако вышеописанный способ предполагает использование твердо-жидкофазного биореактора и/или аэрируемых почвенных площадок в качестве первоначальной обработки сильнозагрязненной почвы. Такой метод снижения уровня загрязнения трудоемок и предполагает нарушение плодородного слоя почвы (гумусированной части почвенного профиля), что не применимо при авариях и разливах нефти и нефтепродуктов в условиях Крайнего Севера (в том числе, в зоне тундры). Поскольку обязательным условием очистки и восстановления нефтезагрязненных мерзлотных почв является сохранение плодородного слоя почвы. Это объясняется тем, что на месте снятия почвенного покрова в мерзлотных условиях возможно образование термокарстовой оттайки с образованием воронок, провалов или аласов, что в свою очередь приводит к развитию термоэрозии и наносит большой ущерб ранимой и трудно восстанавливаемой почвенной экосистеме Крайнего Севера.

Нетрудоемким и наиболее близким к предлагаемому техническому решению, является «Способ очистки мерзлотных почв от нефти спорообразующими бактериями Bacillus subtilis» (11. Патент RU №2446900. Способ очистки мерзлотных почв от нефти спорообразующими бактериями Bacillus subtilis. С2. В09С 1/10 (2006.01). Заявка: 2010129158/13, 13.07.2010. Опубликовано: 10.04.2012. Авторы: Неустроев М.П., Тарабукина Н.П., Неустроев М.М., Сазонов Н.Н., Парникова С.И., Степанова A.M. Патентообладатель: Государственное научное учреждение Якутский научно-исследовательский институт сельского хозяйства Россельхозакадемии), согласно которому, для очистки почвы от нефтяных загрязнений вносят микробный препарат на основе суспензии штамма Bacillus subtilis «Колыма-7/2к». Применение такого микробного препарата позволяет за 3 месяца летнего периода снизить концентрацию нефти до 0,48%.

Одним из недостатков этого способа является неспособность входящего в микробный препарат штамма деградировать нефть в условиях широкого диапазона температур от +8 до +37°C.

Другим недостатком данного способа является то, что в состав микробного препарата входит только один штамм бактерий Bacillus subtilis «Колыма-7/2к», выращенный на мясопептонном агаре при pH 7,0-7,2, в течение 5 суток при температуре +37°C. Как известно биопрепараты, состоящие из двух и более штаммов микроорганизмов, более эффективно утилизируют нефтезагрязнения.

Решение поставленной задачи достигается путем внесения в нефтезагрязненные мерзлотные почвы консорциума микроорганизмов, Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011 и Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017, взятых в соотношении 1:1, для очистки различных типов мерзлотных почв от нефтезагрязнений.

При использовании консорциума микроорганизмов, Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011 и Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017, взятых в соотношении 1:1, для очистки различных типов мерзлотных почв от нефтезагрязнений устраняются все указанные недостатки применения при нефтяном загрязнении биопрепаратов на основе монокультур того или иного типа.

Основная особенность предлагаемого консорциума микроорганизмов состоит в том, что микроорганизмы, входящие в его состав, могут развиваться в широком диапазоне температур (от +8 до +37°C), что делает его перспективным для очистки почв, как в северных, так и в южных широтах.

Характеристика штаммов микроорганизмов, входящих в состав консорциума:

1) Штамм микроорганизмов Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017

Штамм микроорганизмов Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017 выделен из нефтезагрязненной почвы трассы магистрального нефтепровода «Восточная Сибирь - Тихий Океан».

Штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП ГосНИИГенетика - ВКПМ, 117545, г. Москва, 1-ый Дорожный проезд, 1. Коллекционный номер ВКПМ В-11017.

Полученный штамм характеризуется следующими признаками.

Морфолого-культуральные признаки. Грамположительные споровые палочки, в мазках расположены одиночно и короткими цепочками.

На мясопептонном агаре (масс. %: ферментативный пептон - 1,0; натрий хлористый - 0,5; агар - 1,0; вода мясная - остальное, pH 7,0-7,2) с добавлением 1% глюкозы растет в виде сморщенных суховатых бежевых колоний через 1-3 суток колонии окрашиваются в коричневый цвет, субстрат не пигментирует.

На поверхности скошенного мясо-пептонного агара без добавления 1% глюкозы растет в виде сухой морщинистой пленки бежевого цвета.

На среде Сабуро (масс. %: гидролизат рыбной муки - 1,0; панкреатический гидролизат казеина - 1,0; дрожжевой экстракт - 0,2; натрия фосфат однозамещенный - 0,2; D-глюкоза - 4,0; агар - 1,0; вода дистиллированная - остальное; pH 6,0±3) образует крупные колонии грязно-коричневого до болотно-коричневого оттенка крупные колонии диаметром до 1 см и более.

В мясопептонном бульоне (масс. %: ферментативный пептон - 1,0, натрий хлористый - 0,5, вода мясная - остальное; pH 7,0-7,2), растет в виде морщинистой пленки бежевого цвета поверх бульона.

На минеральной среде Мюнца (12. Керстен Д.К. Морфологические и культуральные свойства индикаторных микроорганизмов нефтегазовой съемки - Микробиология, 1963, №5 - С. 1024-1030) с нефтью и нефтепродуктами (дизельное топливо, масло моторное, газовый конденсат) следующего состава: (масс. %) KNO₃ - 0,4; MgO₄·7Н₂О - 0,08; NaCl - 0,1; K₂НРО₄ - 0,14; KН₂РО₄ - 0,06; агар - 2,0; нефть или нефтепродукты - 1,0; вода дистиллированная - остальное, pH - 7,2, в виде непрозрачных матовых серо-бежевых колоний, диаметром 0,1-0,2 см.

Физиолого-биохимические признаки. Штамм хорошо растет при температуре от +8 до +37°C, в аэробных условиях. При температуре ниже +8°C и в анаэробных условиях штамм сразу не погибает, но развивается медленнее. Оптимум роста +30°C. Растет при pH 6,0-8,0. Растет в солевом бульоне с добавлением 0,1-2,0% NaCl.

Штамм каталазоположителен, оксидазоотрицателен. Метаболизм окислительного типа. Биохимическая активность выражена слабо. Не усваивает лизин и орнитин. Не потребляет цитрат и малонат натрия. Желатин не гидролизует. Крахмал не разлагает. Индолоотрицателен. Не образует сероводород. Реакция Фогес - Проскауэра отрицательная. Фенилаланиндезоксаминаза отрицательная. Ферментирует бета галактозидазу.

Штамм не вирулентный, не токсичный, не токсигенный, не фитотоксичен (проверка проведена на белых мышах и семенах высших растений (овес сорт «Скакун» и пшеница сорт «Приленская-19»).

Условия хранения:

1. В лиофилизированном виде в ампулах при +4°C.

2. Штамм может поддерживаться регулярными пересевами (1 раз в 2 недели) на скошенном МПА.

Штамм бактерий может быть получен в лаборатории №2 Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт проблем нефти и газа Сибирского отделения Российской академии наук (ИПНГ СО РАН), 677890, Республика Саха (Якутия), г. Якутск, ул. Октябрьская, дом 1.

2) Штамм микроорганизмов Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011

Штамм бактерий Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011 выделен из нефтезагрязненной почвы трассы магистрального нефтепровода «Восточная Сибирь - Тихий Океан».

Штамм депонирован во Всероссийской коллекции непатогенных промышленных микроорганизмов ФГУП ГосНИИГенетика - ВКПМ, 117545, г. Москва, 1-ый Дорожный проезд, 1. Коллекционный номер ВКПМ В-11011.

Штамм Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011 может быть получен в лаборатории №2 Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт проблем нефти и газа Сибирского отделения Российской академии наук (ИПНГ СО РАН), 677890, Республика Саха (Якутия), г. Якутск, ул. Октябрьская, дом 1. Полученный штамм характеризуется следующими признаками.

Морфолого-культуральные признаки.

Грамположительные палочки, размером 0,8-1,0 мкм. Подвижные. С перитрихиально расположенными жгутиками. В мазках располагаются скоплениями и попарно. Факультативные анаэробы. Спор и капсул не образуют.

На мясопептонном агаре (масс. %: ферментативный пептон - 1,0; натрий хлористый - 0,5; агар - 1,0; вода мясная - остальное, pH 7,0-7,2) формируют влажные, грязно-желтого цвета колонии округлой формы. Через 1-2 суток рельеф колоний изменяется. Колонии становятся суховатыми, края неровные.

На среде Сабуро (масс. %: гидролизат рыбной муки - 1,0; панкреатический гидролизат казеина - 1,0; дрожжевой экстракт - 0,2; натрия фосфат однозамещенный - 0,2; D-глюкоза - 4,0; агар - 1,0; вода дистиллированная - остальное; pH 6,0±3) образует крупные колонии желтовато-оранжевого цвета, максимальный диаметр которых составляет 0,5 см.

В мясопептонном бульоне (масс. %: ферментативный пептон - 1,0, натрий хлористый - 0,5, вода мясная - остальное; pH 7,0-7,2) вызывает диффузное промутнение.

На минеральной среде Мюнца с нефтью и нефтепродуктами (дизельное топливо, масло моторное, газовый кондентсат, бензин) следующего состава: (масс. %) KNO₃ - 0,4; MgSO₄·7H₂O - 0,08; NaCl - 0,1; K₂HPO₄ - 0,14; KH₂PO₄ - 0,06; агар - 2,0; нефть или нефтепродукты - 1,0; вода дистиллированная - остальное, pH - 7,2, в виде непрозрачных матовых грязно-желтых колоний, диаметром 0,1-0,3 см.

Физиолого-биохимические признаки

Штамм растет при температуре от +4 до +37°C, лучше в аэробных условиях. В анаэробных условиях штамм сразу не погибает, но развивается медленнее. Оптимум роста +20 +30°C. Растет при pH 6,0-8,0. Растет в солевом бульоне с добавлением 0,1-2,0% NaCl. Штамм каталаза положителен, оксидаза отрицателен. Метаболизм окислительного типа. Биохимическая активность выражена слабо. Не усваивает многоатомные спирты. Слабо ферментирует глюкозу и сахарозу, другие углеводы не ферментирует. Не усваивает лизин и орнитин. Не потребляет цитрат и малонат натрия. Желатин не гидролизует. Крахмал не разлагает. Индоло отрицателен. Реакция Фогес - Проскауэра отрицательная. Фенилаланиндезоксаминаза отрицательная. Ферментирует бета галактозидазу.

Штамм не вирулентный, не токсичный, не токсигенный, не фитотоксичный (проверка проведена на белых мышах и семенах высших растений).

Штамм может поддерживаться регулярными пересевами (1 раз в 10-14 дней) на скошенном мясопептонном агаре или на минеральной среде с нефтью и нефтепродуктами или храниться в лиофилизированном состоянии в ампулах при +4°C.

Таким образом, преимуществом предлагаемого консорциума микроорганизмов Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011 и Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017, взятых в соотношении 1:1, для очистки различных типов мерзлотных почв от нефтезагрязнений является то, что микроорганизмы, входящие в состав консорциума обладают способностью утилизировать в жидкой минеральной среде как нефть, так и нефтепродукты в относительно короткие сроки (7 суток), в широком диапазоне температур от +8 до +37°C, что позволяет использовать штаммы для дальнейшего биотехнологического производства и очистки субстратов от загрязнений нефтью и нефтепродуктами. Предлагаемый консорциум микроорганизмов может быть использован для реабилитации нефтезагрязненных территорий в условиях Крайнего Севера. Применение предлагаемого консорциума микроорганмзмов Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011 и Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017, взятых в соотношении 1:1, для очистки различных типов мерзлотных почв от нефтезагрязнений позволяет производить эффективную очистку различных типов мерзлотных почв с различными ландшафтными характеристиками от нефтезагрязнений. Результаты исследований показывают, что предлагаемый консорциум микроорганизмов за два месяца осуществляет деградацию нефтезагрязнения в условиях сильнообводненной болотистой местности до 88,6%; в многолетнемерзлых грунтах в условиях равнинной местности - до 73,8%; в мерзлотно-таежной почве в условиях сильно залесенной местности - до 56,4%; в мерзлотных торфяниках - до 45,6% за тот же промежуток времени.

Формула изобретения

Консорциум микроорганизмов Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011 и Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017, взятых в соотношении 1:1, для очистки различных типов мерзлотных почв от нефтезагрязнений.

Изобретение "КОНСОРЦИУМ МИКРООРГАНИЗМОВ Exiguobacterium mexicanum И Bacillus vallismortis ДЛЯ ОЧИСТКИ МЕРЗЛОТНЫХ ПОЧВ ОТ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕНИЙ" (Ерофеевская Л.А.) отмечено юбилейной наградой (25 лет Российской Академии Естествознания)
Медаль Альфреда Нобеля

Оформление наградных документов и заказ каталога