Распространение, культивирование и методы диагностики гриппа типа А

Группа	Научная литература
Область науки	Медицинские науки
Название на русском языке	Распространение, культивирование и методы диагностики гриппа типа А
Авторы на русском языке	Кошеметов Ж.К.

Резюме

В монографии автором представлены экспериментальные материалы и литературные данные по проблеме гриппа типа А, также приведены общее представление и историческая справка и характеристика о гриппе.

Глава 1. Общее представление о гриппе

Высокопатогенный грипп птиц – острая высококонтагиозная вирусная болезнь, поражающая кур и других куриных представителей. Возбудителем болезни является вирус гриппа типа А семейства ортомиксовирусов, имеющий подтиповые варианты, которые устанавливаются двумя наружными белками – гемагглютинином (Н1-Н16) и нейраминидазой (N1-N10). Геном возбудителя способен мутировать, в результате чего может повысить свою патогенность по отношению к птице и приобрести эпидемическую опасность. Вирус птичьего гриппа (семейство Orthomyxoviridae, род Influenzavirus A, B) впервые выделен в Италии в начале XX века.

Вспышки эпидемии вируса гриппа фиксируются ежегодно, пандемии повторяются через 20-70 лет.

Пандемии тяжелого гриппа наблюдались в 1627, 1729, 1788, 1830, 1847,1872, 1890, 1918, 1957 и 1968 годы.

Пандемия 1918 года, так называемая «Испанка», унесшая на несколько десятков млн. жизней больше, чем Первая мировая война, была рекордной по числу жертв. Эта пандемия стала самой смертоносной вспышкой отдельной болезни в истории человечества – по оценкам, она вызвала от 20 до 50 миллионов случаев смерти во всем мире.

На сегодняшний день по данным МЭБ неблагополучными странами по гриппу в период с 2010 по 2017 годы являются Азиатские – Бангладеш, Бутан, Вьетнам, Гонконг, Израиль, Индия, Камбоджа, Малайзия, Индонезия, КНДР, Лаос, Южная Корея, Шри-Ланка, Китай, Лаос, Монголия, Мьянма, Непал, Тайвань, Южная Корея, Япония, Иран, Ливан, Мьянма, Тайвань, Европейские – Турция, Швеция, Болгария, Германия, Дания, Италия, Нидерланды, Россия, Румыния, Сербия, Финляндия, Франция, Румыния, Ирландия, Испания, Португалия, Венгрия, Великобритания, Австрия, Греция, Польша, Словакия, Украина, Финляндия, Хорватия, Швейцария, Литва, Американские – Мексика, Уругвай, Чили, США, Канада, Белиз, Панама, Перу, Африканские – ЮАР, Египет, Буркина-Фасо, Гана, Кот-Д’Ивуа́р, Ливия, Нигер, Нигерия, Алжир, Камерун, Нигерия, Того, Тунис и стран Океания – Австралия.

Глава 2. Культуральные свойства вируса гриппа типа А

В работе, для изучение культуральных свойств вируса гриппа типа А (ВГА) были использованы штаммы А/утка/Альберта/35/76 (Н1N1), А/серебристая чайка/Атырау/2186/07 (Н2N2), А/чирок свистунок/Коргалжын/1797/06 (Н3N8), А/малая поганка/Алаколь/791/04 (Н4N6), А/домашний гусь/Павлодар/1/05 (Н5N1), A/turkey/Massachusetts/3740/65 (Н6N2), А/цыпленок/Росток/29 (Н7N1), А/черноголовый хохотун/Атырау/284/02 (Н13N6), выделенные казахстанскими и мировыми учеными в разные годы из очага эпизоотий. В процессе культивирования предполагалось проведение исследования по подбору оптимальных параметров культивирования, таких как температура культивирования, заражающая доза и продолжительность инкубации.

Изучались культуральные свойства штаммов ВГА в 11 суточных развивающих куриных эмбрионах (РКЭ), перевиваемых линий культур клеток почки зеленой мартышки (Vero), почки собаки (MDCK) и первично-трипсинизированной культуре клеток куриных фибробластах (КФ).

По мере пассирования штаммов ВГА в 11-сут РКЭ гемагглютинирующая активность в РГА составила в пределах 1:250,6±65,43 – 1:1024±0,00, а биологическая активность 5,83 ± 0,083 – 8,5± 0,1 lg ЭИД50/см 3.

Оптимальными параметрами культивирования штаммов А/утка/Альберта/35/76 (Н1N1), А/серебристая чайка/Атырау/2186/07 (Н2N2), А/чирок свистунок/Коргалжын/1797/06 (Н3N8), А/малая поганка/Алаколь/791/04 (Н4N6), А/домашний гусь/Павлодар/1/05 (Н5N1), A/turkey/Massachusetts/3740/65 (Н6N2), А/цыпленок/Росток/29 (Н7N1), А/черноголовый хохотун/Атырау/284/02 (Н13N6) ВГА в РКЭ включают следующие параметры:

- возраст РКЭ 10-11 сут при заражении в аллантоисную полость;

- доза заражения 0,2 см 3 с инфекционной активностью 4,0 lg ЭИД50 на эмбрион;

- температура инкубации РКЭ после заражения 37°C;

- срок инкубирования инфицированных РКЭ 72 часа.

Адаптацию штаммов ВГА проводили к перевиваемым культурам клеток почки собаки (MDCK) и почки зеленой мартышки (Vero), а также к первичной культуре клеток куриных фибробластов (КФ), так как они по данным литературы являются наиболее чувствительными к ВГА.

После проведения 3-х последовательных пассажей штаммов ВГА в монослое перевиваемой линии культур клеток MDCK отмечено, что биологическая и антигенная активность данных штаммов выявлена только на первом пассаже, с активностью 1,5 ±0,00 – 3,55 ±0,00 lg ТЦД50/см³ и 1:8±0,0 – 1:16,0±0,0 соответственно.

Культивирование штаммов ВГА в монослое перевиваемой линии культур клеток Vero также желаемых результатов не дали, так как после первого пассажного уровня биологическая активность штаммов ВГА составила не более 1,75 ±0,00 lg ТЦД50/см 3, а гемагглютинирующая активность 1:2,0±0,0, а штаммы А/малая поганка/Алаколь/791/04 (Н4N6) и А/домашний гусь/Павлодар/1/05 (Н5N1) после первого пассажного уровня не удалось выявить биологическую и гемагглютинирующую активность. Также на втором пассажном уровне в монослоях культур клеток MDCK и Vero обнаружены небольшие деструктивные поражения отдельных клеток монослоя.

При проведении 3-х последовательных пассажей штаммов ВГА в монослое культуры клеток КФ отмечено, что биологическая активность испытуемых штаммов вируса в данной линии клеток выявлена только на первом пассаже, с биологической активностью 3,08±0,01-4,0±0,00 lg ТЦД50/см 3, а гемагглютинирующая активность составила 1:4±0,0-1:16±0,0. Во втором и третьем пассажном уровне в монослое культуры клеток КФ видимых изменений поражения клеток не обнаружено.

С целью инактивирования вируссодержащих суспензий штаммов А ВГА были проведены исследования по отработке методов их инактивации разными концентрациями формальдегида при различных температурах и сроках инактивации. Остаточную вирулентность вируса определяли заражением ими 10-11-суточных РКЭ с последующим 3 кратным пассированием. Активность собранных суспензий аллантоисной жидкости (АЖ) определяли в РГА. Были испытаны следующие концентрации формальдегида – 0,05, 0,08, 0,1 и 0,2%, суспензии инактивировали при 4, 25 и 35°C в течение 24-48 ч.

Реакцию инактивации останавливали добавлением 25% раствора тиосульфата натрия до конечной концентрации 0,25%. Установлено, что инактивирование вируссодержащих суспензий 0,05-0,2% формалином в течение 24-48 ч при 35°C приводит к полной потере вирулентности штаммов ВГА в РКЭ, так как не было выявлено гемагглютинирующей активности собранных АЖ на протяжении 3 последовательных пассажей.

Также для инактивирования вируссодержащих суспензий вышепредставленных штаммов ВГА нами был применен инактивант димер этиленимин (ДЭИ), применяемый в технологии приготовления многих инактивированных гриппозных вакцин. Установлено, что инактивирование выше испытуемых штаммов ВГА 0,1% ДЭИ в течение 24 ч при 35,5°C приводит к полной потере вирулентности вируса в РКЭ, так как не было выявлено гемагглютинирующей активности собранных ВАЖ на протяжении 3 пассажей.

Глава 3. Приготовление диагностических препаратов

С целью приготовления активных и специфичных диагностических препаратов для методов диагностики и идентификации ВГА и его подтипов необходимо получить очищенные и концентрированные препараты данного вируса.

Для выделения и очистки штаммов ВГА из вируссодержащих суспензий нами были апробированы два способа.

В результате проведённых исследований было установлено, что все испытанные нами способы концентрирования и очистки ВГА из ВАЖ показали положительные результаты. Очищенный вирус обладал высокой гемагглютинирующей активностью. Очистка и концентрация штаммов ВГА по первому способу показало более высокий выход вируса и высокую гемагглютинирующую активность выделенных препаратов вируса. Активность очищенных препаратов составила в РГА 1:12800-1:409600, что на 50-200 выше активности исходного вируса.

Для получения специфических сывороток к очищенным препаратам штаммов ВГА в опыте были использованы козы и кролики. Схемы иммунизаций животных для получения специфических сывороток между собой отличались дозами вводимого материала, интервалами между введениями материала и использованиями адъювантов.

Активность полученных кроличьих антисывороток в РТГА составила 1:512-1:8192. В непрямом варианте ТФ-ИФА их активность составила 1:10240-1:51200. Активность козьей антисыворотки составила в ТФ-ИФА 1:25600 и в РТГА – 1:128-1:4096. Все полученные сыворотки была также специфичны в РТГА и ТФ-ИФА, так как не давала перекрестных реакций с гетерогенными антигенами.

Для выделения гемагглютинина (НА) из очищенных препаратов штаммов ВГ А нами были испытаны два способа, разрушения вириона ВГА твин-эфиром и Тритон Х-100 с последующем очистки путем ультроцентрифугированием.

Испытанные нами способы выделения и очистки НА из очищенных препаратов ВГА показали положительные результаты. Выделенные препараты НА показали высокую гемагглютинирующую активность с 1:512 до 1:4096.

Адсорбция НА из очищенного и разрушенного твин-эфиром вируса на формалинизированные эритроциты петуха, после предварительного осаждения NР и неразрушенных вирионов ультрацентрифугированием, показала, что при просмотре этих препаратов в электронном микроскопе и их контроле на чистоту и качество методом электрофореза в 12,5% PAGE, было выявлено наличие в них, кроме НА, также целых и неразрушенных вирионов. Выделение и очистка НА с применением тритона и 25% сахарозы также показала высокую гемагглютинирующую активность препаратов НА+NA, при просмотре этих препаратов в электронном микроскопе и электрофорезе было выявлено только наличие НА ВГА.

Для получения к очищенном препаратом НА ВГА в опыте использованы козы и кролики, так как экспертный комитет ВОЗ для методов по определению антигенной формулы вируса гриппа А рекомендует использование высокоспецифичных антисывороток, приготовленных на животных дающих минимум неспецифических реакций (например, козы) направленных против подтипов HА и NА данного вируса.

Активность кроличьих антисывороток, приготовленных к очищенному препарату НА, составила в РТГА 1:512-1:4096, в непрямом в ТФ-ИФА их активность составила 1:51200-1:102400. Активность козьей антисыворотки составила в ТФ-ИФА 1:20480-1:102400 и в РТГА – 1:128-1:2048, сыворотка также специфична в РТГА.

Глава 4. Методы диагностики

Для ретроспективных серо-эпидемиологических исследований сывороток крови людей с целью определения подъема уровня специфических антител к вирусу гриппа определенных серотипов чаще всего используют реакцию торможения гемагглютинации (РТГА).

Для оптимизации условий постановки РТГА при ВГА в опытах были испытаны эритроциты различных видов животных и птиц: барана, петуха, индюка, гусей и уток в различных концентрациях 3, 2, 1 и 0,75%. В результате проведенных опытов по подбору эритроцитов для постановки РТГА со штаммами ВГА были получены идентичные результаты.

В связи с этим для типизации ВГА рекомендуются следующие условия постановки РТГА:

- применение специфической козьей антисыворотки, полученный на очищенный антиген НА штаммов ВГА;

- при получении антигена НА штаммов ВГА для гипериммунизации животных использовать высокоочищенный препарат данного белка, выделенного с применением неионного детергента NР-40, а схема постановки РТГА при ВГА предлагается следующем варианте:

- перед постановкой РТГА, сыворотки крови необходимо обрабатывать рецептор-разрушающим энзимом в соотношении – 1:4 в течение 18 ч при 37°C в термостате, затем сыворотки инактивировать при 56°C в течение 50 мин. После инактивации разведения сывороток необходимо довести до 1:10 с помощью 0,15М натрия хлорида с рН 6,8-7,4 или же испытуемые и контрольные сыворотки развести этим же раствором до разведения – 1:5, затем в каждую пробу сывороток добавить равное количество 20%-ного раствора каолина и встряхивать смесь в течение 20 мин при комнатной температуре, и затем осветлить центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 мин и использовать в РТГА.

- во все лунки микропланшет с U-образным дном наливается 0,15М натрия хлорид с рН 6,8-7,4 в объёме 0,025 cм³;

- по вертикали в лунках микропланшет титруют испытуемые пробы сывороток крови от больных и подозреваемых в заболевании ВГА, начиная с разведения от 1:10 до 1:2560;

- затем во все лунки микропланшет вносят по 0,025 cм³ инактивированного антигена ВГА в рабочем разведении, и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре;

- после контакта сывороток с антигеном во все лунки вносят по 0,05 cм³ 0,75%-ной суспензии эритроцитов петуха и выдерживают в течение 30 мин при комнатной температуре. После чего проводится учёт результатов реакции.

В дальнейшем оптимизированный вариант постановки РТГА был испытан нами для выявления специфических антител ВГА. В качестве исследуемых материалов использовали панель референтных антисывороток против НА подтипов Н1-Н15 ВГА (Медицинское исследовательское подразделение Военно-морских сил США «NAMRU-3» г. Каир, Египет). В качестве антигена при постановке РТГА использовали штаммы А/утка/Альберта/35/76 (Н1N1), А/серебристая чайка/Атырау/2186/07 (Н2N2), А/чирок свистунок/Коргалжын/1797/06 (Н3N8), А/малая поганка/Алаколь/791/04 (Н4N6), А/домашний гусь/Павлодар/1/05 (Н5N1), A/turkey/Massachusetts/ 3740/65 (Н6N2), А/цыпленок/Росток/29 (Н7N1), А/черноголовый хохотун/Атырау/284/02 (Н13N6) ВГА в рабочих разведениях.

Штаммы ВГА использованные нами в качестве антигена при постановке РТГА положительно реагировали только с сывороткой против антигенов штаммов ВГА, а с сыворотками против подтипов Н8-Н12, Н15 и вируса болезни Ньюкасла реагировали отрицательно.

С целью получения специфических антигенов ВГА птиц для прямого варианта ТФ-ИФА проводились исследования по отработке оптимальных методов их приготовления.

Антигены для постановки ИФА готовили четырьмя способами. Для концентрирования и очистки антигенов ВГА пригодны все испытанные способы его приготовления. Но более активные культуральные антигены получены с использованием второго способа, где активность препаратов после обработки наиболее высокая, активность антигена в РГА составила 1:512-1:1024, в РДП – 4-8 и в ТФ-ИФА-1:6400-1:51200.

Наиболее важным фактором, влияющим на чувствительность, специфичность и воспроизводимость ИФА, является качество используемых конъюгатов. В свою очередь качество конъюгатов находится в прямой зависимости от качества (чистоты, активности и специфичности) используемых для конъюгации иммуноглобулинов и антител. В связи с этим, первым этапом исследований в этом направлении была отработка условий выделения и очистки активных и специфичных иммуноглобулинов и антител из специфических и антивидовых сывороток.

Гаммаглобулиновые фракции из вирусспецифических сывороток полученных на козах к штаммам ВГА выделяли различными методами:

1. Ступенчатым осаждением альбумина и иммунных глобулинов, различными концентрациями этилового спирта по методу Кона;

2. Трехкратным осаждением общей глобулиновой фракции насыщенным раствором сульфата аммония при 40%, 35% и 33% степени насыщения раствора по общепринятой методике;

3. Осаждение гаммаглобулина из сыворотки крови спиртово-хлороформным методом.

Наиболее активные и специфичные иммуноглобулины были получены с помощью спиртового осаждения по Кону, в то время конъюгаты, приготовленные на основе иммуноглобулинов, выделенных по методу Кона, были достаточно специфичными в ИФА.

В ходе оптимизации условий постановки прямых вариантов ТФ-ИФА была испытана оптимальная сенсибилизирующая доза гамма-глобулинов, отработаны оптимальные рабочие дозы антигенов и конъюгатов к белкам ВГА. Также проведена отработка температурно-временных условий контакта иммунореагентов между собой и подбор солевых растворов для их разведения при постановке ТФ-ИФА.

Исследования по отработке оптимальных условий постановки данных вариантов ТФ-ИФА при ВГА показали, что наибольшей чувствительности метод достигает при следующих параметрах постановки реакции:

1. Сенсибилизация лунок полистироловых планшетов вирусспецифическим гамма-глобулином, взятым в рабочей концентрации, в течение 18 ч при температуре 4°C с дальнейшей обработкой лунок 1%-ным раствором БСА в течение 60 мин при температуре 37-38°C.

2. Время контакта испытуемых и контрольных антигенов с гамма-глобулинами в течение 18 ч при температуре 4°C или 3 ч при 37°C.

3. Взаимодействие вирусспецифических конъюгатов с антигенами в течение 50 мин при температуре 37-38°C, а затем с субстратом в течение 30-60 мин при 24°C.

4. Учет результатов реакции проводили на фотометре марки «Мультискан» при длине волны 405 нм (для АБТС).

Результат считали положительным, если оптическая плотность испытуемого антигена в 2 и более, раз превышает оптическую плотность контрольного (нормального) антигена. Оптическая плотность положительных проб должна быть не ниже 0,15.

Для титрования в ИФА сывороток от переболевших и вакцинированных против ВГА кур необходим антивидовой – против глобулинов кур – иммунопероксидазный конъюгат. Целью настоящих исследований была отработка оптимальных схем гипериммунизации доноров видоспецифических антител (кроликов) препаратами сывороточного гаммаглобулина кур.

В качестве антигена для иммунизации кроликов использовали гаммаглобулин кур выделенный нами по методу Кона.

Иммунизация кроликов гаммаглобулином кур проводили по одной схеме.

За неделю до начала цикла гипериммунизации подколенные лимфатические узлы кроликов сенсибилизировали непольным адъювантом Фрейнда в дозе 1 cм³ на каждого кролика.

Схема гипериммунизации включала 5 введений гаммаглобулина кур с недельным интервалом в область подколенных лимфатических узлов.

Глобулин вводили в возрастающей дозе (2; 2,5; 3; 3,5; 4 мг) на одного кролика в комплексе с равным объемом польного адъюванта Фрейнда.

Антивидовые сыворотки, полученные на кроликах, обладали высокой преципитирующей активностью 4,5±0,08 – 10,8±0,8 log2.

Для следующего этапа исследований по выделению и очистки антивидовых антител были испытаны методы: спиртовое осаждение гаммаглобулина по Кону и аффинная очистка антител по методу Аврамса и Терника.

Очищенная антитела по методу аффинная очистка антител по Аврамса и Терника имеют сравнительно высокую активность в РДП.

Исследованиями по оптимизации условий постановки непрямого ТФ-ИФА с целью выявления специфических к ВГ А птиц антител установлены следующие параметры реакции:

- сенсибилизация лунок полистироловых планшетов специфическим антигеном, взятым в рабочей концентрации на 0,01М ФСБ с рН 7,2-7,4 в течение 2 ч при 37°C или 16-18 ч при 4°C;

- время инкубации наполнителя (1%-ного БСА) на сенсибилизированных антигеном лунках планшетов в течение 60 мин при 37°C;

- далее в лунки планшетов вносятся разведения исследуемых и контрольных сывороток, начиная с разведения 1:200, контакт в течение 1,5 ч при 37°C;

- после контакта с сыворотками в лунки планшетов вносится рабочий раствор антивидового конъюгата, контакт в течение 50 мин при 37°C;

- после контакта с конъюгатом вносят рабочий раствор субстрата.

В процессе постановки непрямого ТФ-ИФА после контакта с каждым компонентом реакции планшеты трижды промывают отмывочным буфером, а перед внесением субстрата промывают 5-6 раз.

Учёт результатов реакции проводили на спектрофотометре марки «Multiscan Plus» при длине волны 405 нм (для АБТС).

Результат считается положительным, если оптическая плотность испытуемой сыворотки в 2 и более раз превышает оптическую плотность контрольной (нормальной) сыворотки. Оптическая плотность положительных проб должна быть не ниже 0,15.

Глава 5. Применение методов диагностики при проведении мониторинга по гриппу типа А

Отработанные варианты тест-системы успешно были применены для обнаружения антигенов подтипов ВГА и антител к нему в пробах диких и домашних птиц собранных в ходе мониторинга на территории Республики Казахстан, Таджикистан и Кыргызстан.

По результатам этого мониторинга можно сделать заключение, что с 2006 года организовано и проведено 32 экспедиционных выездов в разные регионы Республики Казахстан, а также в Республику Таджикистан и Кыргызстан. По результатам экспедиционного выезда собраны 7034 проб от диких и домашних птиц, для проведения лабораторных исследований по выделению вируса гриппа типа А. Лабораторные исследования собранных проб включали постановку традиционного ПЦР, ИФА, РТГА и вирусовыделение на РКЭ. По результатам лабораторных исследований в образцах патологических материалов от диких и домашних птиц из Республики Казахстан и Таджикистан были обнаружены вирус гриппа типа А с антигенной формулой Н5N1. Также на этих регионах циркулирует вирус болезни Ньюкасла среди птиц.

Учитывая глобальную опасность гриппа типа А и возможность развития пандемии разработаны научно-обоснованные краткосрочные и долгосрочные рекомендации по предупреждению и ликвидации инфекции на территории Республики Казахстан, Таджикистан и Кыргызстан, позволяющие оптимально и целенаправленно планировать мероприятия по предупреждению и ликвидации заболевания в стране.

Издание "Распространение, культивирование и методы диагностики гриппа типа А" (Кошеметов Ж.К.) отмечено наградой
МЕДАЛЬ «ЗА ВЕРНОСТЬ ТРАДИЦИЯМ ОТЕЧЕСТВЕННОГО ОБРАЗОВАНИЯ» С УДОСТОВЕРЕНИЕМ

Оформление наградных документов и заказ каталога